Опыт 6.3. Изучение влияния различных значений рН на активность фермента

Материалы и оборудование

Реактив Бенедикта

Буферные растворы с рН 3, 5, 7, 9 и 11

1%-ный раствор крахмала

Водяная баня с температурой 38°С

Бунзеновская горелка

Асбест

Держатель для пробирок, штатив с пробирками

Градуированные пипетки на 5 мл

Термометр

Таймер

Дистиллированная вода

Исходный раствор слюны

Амилаза (такая же, как та, которая содержится в слюне)

Методика

1. Сполосните рот 5 мл дистиллированной воды и выплюньте эту воду.

2. Наберите в рот 10 мл дистиллированной воды, пополощите в течение 1 мин и эту жидкость соберите.

3. Доведите объем этого раствора амилазы слюны до 40 мл дистиллированной водой.

4. Проверьте растворы амилазы, крахмала и буферные растворы на присутствие в них редуцирующих Сахаров с помощью реактива Бенедикта.

5. Пометьте этикеткой "рН 3" одну из пробирок и внесите в нее 2 мл раствора крахмала.

6. Добавьте в ту же пробирку 2 мл буферного раствора с рН 3 и тщательно перемешайте оба раствора.

7. Прокипятите не менее 4 мл раствора фермента и влейте 4 мл этого раствора в пробирку с соответствующей этикеткой.

8. В другую пробирку, также снабженную этикеткой, влейте 4 мл раствора фермента, не подвергавшегося кипячению; поставьте все три пробирки на водяную баню и выждите некоторое время (около 1 мин) для того, чтобы они успели нагреться до 38°С.

9. Влейте небольшое количество реактива Бенедикта в каждую из 11 пробирок и пометьте их цифрами 1-11.

Три следующие операции (10-12) провести очень быстро:

10. Когда растворы на водяной бане примут ее температуру, влейте забуференный раствор крахмала в некипяченый раствор фермента.

11. Хорошо перемешайте оба раствора, переворачивая пробирку, а затем снова поставьте пробирку на водяную баню.

12. Включите отсчет времени и сразу же перенесите небольшое количество реакционной смеси (примерно равное по объему взятому реактиву Бенедикта) в пробирку 1.

13. На протяжении всего опыта энергично встряхивайте смесь.

14. По истечение 1 мин перенесите в пробирку 2 вторую порцию реакционной смеси (приблизительно того же объема, что и первая).

15. Повторяйте ту же процедуру с интервалами 1 мин в течение еще 9 мин (т. е. заполните отобранными пробами пробирки 3-11).

16. Отметьте для пробирок 1-11 продолжительность инкубации, требуемой для появления первых признаков положительной реакции Бенедикта (выпадения кирпично-красного осадка).

17. Повторите тот же опыт с прокипяченным раствором фермента, начиная от п. 7.

18. Повторите весь опыт целиком с каждым из остальных буферных растворов.

19. Постройте график зависимости времени гидролиза от рН и объясните полученные результаты.

6.3. а) Укажите оптимальное значение активности фермента В на рис. 6.14.

Рис. 6.14. Влияние рН на активность трех ферментов - А, В, и С

б) Назовите в качестве примера какие-либо известные вам ферменты, активность которых могла бы характеризоваться: 1) кривой А и 2) кривой В.

д) К раствору пероксида водорода добавляли при разных значениях рН по 1 мл раствора каталазы и отмечали время, за которое удавалось собрать 10 мл О₂. При этом были получены следующие результаты:

Представьте эти результаты в виде графика и объясните их.