22.4.2. Репликация ДНК

Модель структуры ДНК в виде двойной спирали, предложенная Уотсоном и Криком, описана в разд. 5.6.3. Одна из самых привлекательных особенностей этой модели состоит в том, что она одновременно подсказывает, каким способом могла бы происходить репликация ДНК. Уотсон и Крик высказали предположение, что две цепи, образующие спираль, могут раскручиваться и разделяться, после чего каждая из них служит матрицей, к которой путем спаривания оснований пристраивается комплементарная цепочка нуклеотидов. Таким образом, из каждой исходной молекулы ДНК получаются две копии с идентичной структурой.

В 1956 г. Корнбергу удалось продемонстрировать in vitro синтез молекулы ДНК, используя в качестве матрицы одиночную цепь ДНК. (Этот метод был затем использован другими учеными для выяснения природы генетического кода; см. разд. 22.5.) Корнберг выделил из Е. coli и очистил фермент, который способен связывать друг с другом свободные нуклеотиды в присутствии АТФ как источника энергии с образованием комплементарной цепи ДНК. Он назвал этот фермент ДНК-полимеразой. В своих последующих экспериментах Корнберг использовал вместо нуклеотидов и АТФ дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ), из которых тоже строилась комплементарная цепь ДНК. Дальнейшие данные подтвердили, что именно в этой форме нуклеотиды легко присоединяются к ДНК-матрице и друг к другу. Когда нуклеозидтрифосфаты связываются между собой, две концевые фосфатные группы отщепляются. Оставшаяся фосфатная группа нуклеотида и освобождающаяся энергия используются для образования эфирной связи с углеродными атомами 5 и 3 остатков сахара соседних нуклеотидов (рис. 22.14).

Позднее, в 1967 г., Корнберг показал, что ДНК - полимераза присоединяет нуклеотиды только в направлении 5 → 3. Поскольку две цепи ДНК антипараллельны, т. е. направление 5 → 3 у них противоположно, ДНК-полимераза может непрерывно строить лишь одну новую цепь молекулы ДНК. Другая дочерняя молекула ДНК синтезируется отдельными короткими участками под действием ДНК-полимеразы, движущейся в противоположном направлении^*. Эти короткие участки новосинтезируемой полинуклеотидной цепи связываются воедино другим ферментом - ДНК-лигазой (рис. 22.15). Молекулы ДНК, синтезируемые in vitro в присутствии ДНК-лигазы, биологически активны и могут использоваться в системе синтеза белка. Молекулы ДНК, полученные в 1956 г. Корнбергом, хотя они имели в целом правильную структуру, были лишены биологической активности, так как участки одной из синтезируемых цепей не могли соединиться друг с другом.

^* (На рис. 22.14 этот факт не отображен: показано, будто обе цепи реплицируются одной молекулой ДНК- полимеразы, движущейся в одном направлении. В этом отношении приведенная на рисунке схема неправильна.- Прим. ред).

Способ репликации ДНК, предложенный Уотсоном и Криком и показанный на рис. 22.16, известен под названием полуконсервативной репликации, так как при этом каждая новая двойная спираль сохраняет одну цепь исходной двойной спирали ДНК. Этот механизм основан на данных, полученных Мезелсоном и Сталем в серии классических экспериментов в 1958 г. Клетки Е. coli содержат одну кольцевую хромосому; при выращивании этих клеток в течение многих поколений на среде, содержащей тяжелый изотоп азота (¹⁵N), вся их ДНК метилась этим изотопом. Клетки с меченой ДНК переносили на среду, содержавшую обычный изотоп азота ¹⁴N. По прошествии срока, соответствующего времени генерации Е. coli (50 мин при 36°С), брали пробы клеток, выделяли из них ДНК и центрифугировали 20 ч при 40 000 g в растворе хлористого цезия (CsCl). При этом тяжелые молекулы CsCl начинали осаждаться, образуя градиент плотности, которая возрастала от верхушки к дну пробирки. ДНК собиралась на том уровне, на котором плотность раствора CsCl была равна ее плотности. При исследовании в ультрафиолетовых лучах ДНК в центрифужной пробирке имела вид узкой полосы. Расположение полос ДНК, выделенной из клеток, выращенных на средах с ¹⁵N и с ¹⁴N, и интерпретация их структуры представлены на рис. 22.16. Эти эксперименты убедительно показали, что репликация ДНК происходит полуконсервативным способом.

22.2. Были выдвинуты три гипотезы для объяснения процесса репликации ДНК. Один вариант получил название полуконсервативного; он описан выше и представлен на рис. 22.14. Две другие гипотезы - о консервативной репликации и о дисперсивной репликации-представлены на рис. 22.17.

Нарисуйте схемы распределения различных типов ДНК в градиенте плотности, которые обнаружили бы Мезелсон и Сталь для двух первых поколений клеток, если бы были верны консервативная и дисперсивная гипотезы.