Нингидриновая реакция

С нингидрином реагируют аминогруппы как свободных аминокислот, так и связанных, входящих в состав белка, причем характер образующихся продуктов зависит от pH среды (при p<H5 окрашивания не возникает). При взаимодействии аминокислоты с двумя молекулами нингидрина при p>H5 образуются: 1) альдегид соответствующей аминокислоты в результате ее восстановления; 2) углекислый газ (из кислорода нингидрина и углерода аминокислоты); 3) вода; 4) окрашенное соединение, возникшее в результате усложнения (сдваивания) молекулы нингидрина и присоединения к ней азота аминокислоты. Это окрашенное соединение и определяет нингидриновую реакцию.

При проведении реакции следует избегать контакта срезов с водой, так как при этом легко вымываются свободные аминокислоты. Чтобы определить, есть ли свободные аминокислоты, следует отмыть их и затем сравнить между собой интенсивность реакций на аминогруппы свободных аминокислот и белков и на аминогруппы белков. Различие в интенсивности окраски укажет на присутствие свободных аминокислот.

Нингидриновую реакцию предпочтительнее осуществлять па свежем материале. Однако иногда можно использовать фиксированный материал.

Для проведения нингидриновой реакции на микротомных препаратах рекомендуется фиксация в спирте или 10%-ном формалине. Проводку материала следует производить как можно быстрее; пребывание в разогретом парафине свести до минимума. Для этого нужно чаще сменять парафин (3 раза по 20 мин). Окрашивание срезов на постоянных препаратах зависит только от присутствия белка, так как свободные аминокислоты теряются во время фиксации.

Реактивы

1) 0,5-1%-ный водный раствор нингидрина.

2) 5%-ная трихлоруксусная кислота.

Проведение реакции на белки и аминокислоты

1. Поместить срезы в 0,5-1%-ный водный раствор нингидрина на предметное стекло.

2. Подогреть препарат до появления синей окраски.

3. Накрыть срез покровным стеклом и незамедлительно рассмотреть препарат, так как окраска быстро исчезает.

Проведение реакции на белки

1. Промыть срезы в 5%-ной трихлоруксусной кислоте в течение 10-15 мин в часовом стекле для удаления свободных аминокислот.

2. Сполоснуть срезы в воде.

3. Провести нингидриновую реакцию.

Если окрашивание исчезает, следовательно, его давали аминокислоты; если окрашивание сохранится, значит, присутствуют аминогруппы белка. При наличии аминогрупп аминокислот и аминогрупп белка может получиться промежуточное окрашивание.

Результаты реакции (табл. 9, 10, 11)

Таблица 9. Нингидриновая реакция. Лист капусты. 1 - эпидермис; 2 - паренхима листа; 3 - колленхима пучка; 4 - ксилема; 5 - камбий; 6 - флоэма (увеличение 7 X 8)

При малом увеличении микроскопа видно, что реакция в той или иной степени осуществляется во всех клетках листа капусты. Паренхима дает слабое окрашивание, более интенсивно окрашиваются эпидермис и лежащие непосредственно под ним слои паренхимы. Наиболее интенсивную реакцию дают клетки пучка, за исключением сосудов ксилемы, которые, как и следует ожидать, совсем не окрашиваются. При большом увеличении микроскопа видно, что наиболее интенсивно реакция осуществляется в клетках камбия и флоэмы.

Таблица 10. Нингидриновая реакция. Проводящий пучок листа капусты. 1 - колленхима пучка; 2 - паренхима пучка; 3 ксилема; 4 - паренхима ксилемы; 5 - камбий; 6 - флоэма (увеличение 7 X 40)

Сравнение результатов реакции на аминогруппы белков и аминокислот и аминогруппы только белков показывает, что аминогрупп белков в клетках листа капусты мало, поэтому окрашивание клеток происходит в основном за счет свободных аминокислот. Наибольшая интенсивность окраски камбия указывает на присутствие в нем большого количества свободных аминокислот, что связано с синтетической деятельностью его клеток. Яркая окраска флоэмы объясняется тем, что в ней проходит ток веществ, служащих для построения живого тела растения.

Таблица 11. Нингидриновая реакция. Зерновка кукурузы. А - общий вид зерновки кукурузы в разрезе; Б - детали строения зерновки кукурузы; 1 - зародышевый корешок; 2 - щиток; 3 - всасывающий эпителий; 4 - алейроновый слой и прилегающие клетки эндосперма; 5 - алейроновый слой в нижней части зерновки; 6 - эндосперм около средней части щитка; 7 - эндосперм из центральной части зерновки; 8 - колеоптиле; 9 - точка роста почечки; 10 - проводящие пучки; 11 - колеориза (увеличение 7 X 8 и 7 X 40)

При рассмотрении зерновки кукурузы под микроскопом можно увидеть, что зародыш и эндосперм резко различаются по интенсивности окраски. Эндосперм и алейроновый слой остаются почти бесцветными; зародыш окрашивается очень ярко, что, очевидно, указывает на активно идущие процессы синтеза в этом развивающемся организме.

Так же как в листе капусты, окрашивание обусловлено свободными аминокислотами.

В зародыше наиболее интенсивно окрашивается почечка и особенно корешок, а также эпителиальный слой щитка и проводящие пучки, идущие от него к зародышу. По-видимому, эпителий щитка, являясь органом превращения крахмала и гидролиза белков, содержит большое количество аминокислот и передает их по проводящим элементам в развивающиеся части зародыша для синтеза белка.

По мере прорастания зерновки несколько усиливается реакция в эндосперме, очевидно, за счет усиления процессов его растворения.

Если желается сделать заказ услуги глубокий минет с проститутками, навестите страницы сайта https://prostitutki-tumen.men/serv/glubokij-minet/. Список исполнен действительными предложениями в разнообразых расценочных масштабах.