Миллонова реакция

Тирозин, который встречается во многих белках, - единственная аминокислота, которая дает реакцию с реактивом Миллона. Тирозин содержит 3 атома углерода и является производным аланина, отличаясь от него тем, что один атом водорода у β-углеродного атома замещен на оксифенольный радикал.

Реакция с реактивом Миллона возникает вследствие наличия у тирозина оксифенольного кольца. Эту реакцию дают также содержащие тирозин белки и многие фенолы и их производные. Поэтому она малоспецифична и ее лучше проводить с контролем, удаляя тирозин трихлоруксусной кислотой и фенолы 96%-ным спиртом.

Миллонова реакция высокочувствительна. В процессе реакции, по-видимому, образуется нестойкий комплекс фенола с ртутью. В дальнейшем, присоединяя нитрат, он превращается в относительно стойкое окрашенное соединение. Химизм этой реакции еще не вполне расшифрован.

Для получения постоянных препаратов с реакцией Миллона используют фиксированный в спирте или формалине материал. При этом рекомендуется максимально окрасившиеся в течение нескольких часов срезы промыть в 2%-ной азотной кислоте, затем быстро обезводить в спиртах (70%-ном и 100%-ном) и заключить в канадский бальзам.

Фиксированный материал окрашивается исключительно за счет тирозина белков, так как свободные аминокислоты теряются при фиксации (как и в случае с нингидриновой реакцией).

Реактивы

1) Реактив Миллона (нитрат ртути (I) ).

Приготовление реактива Миллона. Первый способ: 1 мл (13,6 г) ртути растворить в 9 мл концентрированной азотной кислоты (уд. вес 1,52) и разбавить водой (1:1). Второй способ: приготовить 4%-ную азотную кислоту и насытить ее кристаллами нитрата ртути, неоднократно встряхивая раствор в течение нескольких дней; полученный раствор профильтровать и к 400 мл его добавить 3 мл 40%-ной азотной кислоты и 1,4 г нитрата натрия. Последний способ приготовления реактива выгодно отличается от предыдущего, так как первый дает очень разнообразные химические соединения, осложняющие течение реакции.

2) 5%-ная трихлоруксусная кислота.

3) 96%-ный спирт.

Проведение реакции

1. Поместить срез в каплю реактива Миллона на 10-15 мин, покрыв его покровным стеклом.

2. Наблюдать появление розовой или красновато-коричневой окраски в местах нахождения тирозина, содержащих тирозин белков и фенолов.

Как было сказано выше, миллонова реакция осуществляется не только с тирозином, но и с содержащими тирозин белками и фенолами. Для того чтобы определить, с какими из этих соединений прошла реакция, нужно повторно провести реакцию, предварительно удалив из одних срезов тирозин, из других фенолы. Сравнение интенсивности окраски этих срезов с окраской срезов, обработанных только реактивом Миллона, позволяет судить о наличии или отсутствии тирозина.

Удаление тирозина

1. Поместить срез в 5%-ную трихлоруксусную кислоту в часовое стекло, сменить ее несколько раз в течение 5-15 мин.

2. Промыть срез водой.

3. Провести реакцию Миллона.

Если реакция станет отрицательной, значит, ее давала аминокислота тирозин. Если реакция останется положительной, следовательно, она возникает за счет содержащих тирозин белков или фенолов. Для выяснения вопроса о том, какие из этих веществ дают реакцию, следует провести ее еще раз, удалив фенолы.

Удаление фенолов

1. Промыть срезы в часовом стекле 96%-ным спиртом, сменяя его 3-5 раз в течение 5-15 мин.

2. Промыть срезы водой.

3. Провести реакцию Миллона.

Если реакция останется положительной, значит, ее давали не фенолы, а белки. Если реакция станет отрицательной, следовательно, в препарате были фенолы.

Результаты реакции (табл. 12, 13)

Таблица 12. Миллонова реакция. Проводящий пучок листа капусты. 1 - колленхима пучка: 2 - паренхима пучка; 3 - ксилема; 4 - паренхима ксилемы; 5 - камбий; 6 - флоэма (увеличение 7 X 40)

В листе капусты реакция Миллона идет не только за счет тирозина, но и за счет содержащих тирозин белков. Интенсивность ее после удаления тирозина несколько снижается. Наименьшая интенсивность окраски наблюдается в толще паренхимы листа, несколько большая - в поверхностных слоях паренхимы и в эпидермисе, а также в колленхиме и паренхиме пучка. Наиболее интенсивна окраска в камбии и флоэме. Однако даже в местах наибольшей интенсивности окраски она не является яркой. Локализация окрашенного вещества при этой реакции сходна с локализацией его при нингидриновой реакции.

Таблица 13. Миллонова реакция. Зерновка кукурузы. А - общий вид зерновки кукурузы в разрезе; Б - детали строения зерновки кукурузьк 1 - зародышевый корешок; 2 - щиток; 3 - всасывающий эпителий; 4 - алейроновый слой и прилегающие клетки эндосперма; 5 - алейроновый слой в нижней части зерновки; 6 - эндосперм около средней части щитка; 7 - эндосперм из центральной части зерновки; 8 - колеоптиле; 9 - точка роста почечки; 10 - проводящие пучки; 11 - колеориза (увеличение 7 X 8 и 7 X 40)

В зерновке кукурузы окраска возникает главным образом за счет связанного в белках тирозина, свободного тирозина почти нет. Зародыш дает более яркую окраску, чем эндосперм.

Однако и компоненты эндосперма дают явное окрашивание, особенно алейроновый слой и прилежащие к нему клетки, а также клетки эндосперма, расположенные вдоль эпителия щитка. Это указывает на большое количество белка в зоне алейронового слоя и, возможно, на приток продуктов гидролиза белка к эпителию щитка. В зародыше реакция протекает наиболее интенсивно в почечке и корешке, что связано с наибольшей заполненностью белками и аминокислотами этой части зародыша, по и в щитке реакция происходит достаточно интенсивно.

Предпочитаете заниматься совокуплением в компании местной индивидуалки? Интим сайт prostitutkiyaroslavlya365.top призывает воспользоваться услугами великолепных проституток, которые готовы даже на опыты в интиме.