Электрофизиологический метод изучения двигательной активности насекомых (С. Датки, М. Шехтер, В. Салливэн)

При длительном изучении активности насекомых большую пользу приносят записывающие устройства. Эти устройства должны быть простыми, надежными и действующими автоматически в течение длительных периодов.

Очень часто насекомые реагируют на раздражения не одинаково в течение суток, а лишь в определенные периоды, зависящие от суточной активности, времени после вылупления и от ряда других факторов. В некоторых случаях возможность проводить измерения без непосредственного контакта с подопытными насекомыми, нарушающего их нормальную жизнедеятельность, имеет большое значение.

В ряде опытов с успехом применялся метод введения электродов в закрепленное насекомое. Когда насекомое пыталось двигаться, от электродов поступали сигналы. Преимущества такого метода состоят в жесткости системы и отсутствии внешних воздействий, которые могли бы исказить результаты опыта.

Длительная регистрация сигналов, поступающих от электродов, а также двигательной активности отчетливо показывает, что в изменениях интенсивности наблюдается довольно строгая периодичность. Этот факт представляется нам очень интересным, заслуживающим изучения и немалых размышлений.

Биологические ритмы наблюдаются у большинства организмов в природе, как растений, так и животных. У одних ритмов период равен суткам, у других он больше. Опыты показывают, что даже те ритмы, которые связаны с периодическим изменением интенсивности освещения, сохраняются при постоянном уровне освещения.

Методы и материалы

В большинстве наших опытов мы использовали таракана Leucophaea maderae (F.) - насекомое, биологические ритмы которого изучали уже многие авторы. Таракан этот очень живуч, длительное время может обходиться без пищи и воды и активен только ночью. Измерения проводились на взрослых двухнедельных самцах таракана, выросших в коробке в темной комнате и за неделю до опыта помещенных в стеклянную банку с пищей и водой, где они жили при нормальной смене дневного и ночного освещения.

При подготовке к введению электродов тараканов усыпляли углекислым газом, стерилизовали, погружая в 0,5%-ный раствор гипохлорида соды, и приклеивали крыльями при помощи куска изоляционной ленты к пластмассовому блоку размером 1,8 × 9,6 см (фиг. 1). Задние ножки тараканов скрепляли изоляционной лентой и в коксу вводили стерильный серебряный электрод диаметром 0,32 мм. Электроды вводили в мембрану между дистальным концом коксы и вертлугом каждой задней ноги и направляли внутрь к проксимальному концу коксы. Выводные концы электродов прочно закрепляли ниже второй пары ног при помощи куска изоляционной ленты. Аналогичным образом электроды прикреплялись к пластмассовому блоку. Накладывая изоляционную ленту, необходимо предусмотреть возможность для выхода фекалий.

Фиг. 1. Таракан Leucophaea maderae с серебрянными электродами, введенными в коксу задних ног

При прочном креплении таракана и электродов получается вполне надежная система, которая может выдержать толчки, вибрацию и повороты. Двух скрепленных спинами тараканов помещали в запаянный сосуд (фиг. 2), в котором содержалось 55% кислорода и 45% азота. Для поглощения СО₂ в сосуде находилась гидроокись лития (6 г), а для очистки воздуха - активизированный древесный уголь (6 г). Сигналы от электродов могут поступать в течение 10-14 дней и не прекращаются даже при уменьшении давления до 1/8 атм. Если обеспечить прикрепленных тараканов пищей и водой, то они живут намного дольше.

Фиг. 2. Два таракана с электродами, скрепленные для помещения в сосуд, где поддерживается определенный состав воздушной среды

Сигналы от электродов поступают в трехкаскадный усилитель на транзисторах (фиг. 3) с коэффициентом усиления по напряжению 10000. Этот усилитель имеет низкое входное сопротивление (около 3000 ом на частоте 1000 гц) и поэтому его нельзя использовать для сложных задач измерения потенциалов мышц и нервов без добавления каскада с большим входным сопротивлением. Однако в данном случае эта схема вполне удовлетворительна, так как сопротивление тела таракана порядка 2-16 ком, причем низкое входное сопротивление усилителя уменьшает шумы.

Фиг. 3. Трехкаскадный усилитель электрофизиологических сигналов от таракана

В период покоя таракана сигналы имели величину 10-20 мкв, а в период активности - до 1 мв. Выходной сигнал усилителя поступал на осциллоскоп или на самописец для последующего изучения формы и частоты сигналов. Конденсатор 0,01-0,1 мф на выходных клеммах служил для фильтрации помех (белого шума). Выход усилителя соединялся с входом схемы удваивающего напряжение интегратора^* (фиг. 4). Выходное напряжение интегратора поступает на самописец, предназначенный для длительного периода работы (сигналы до 50 мв, скорость протяжки бумаги 2,5 см/час). Во избежание клякс и чрезмерного износа пера постоянная времени самописца должна быть очень большой. Выходной потенциометр интегратора настраивается так, чтобы при максимальной активности тараканов перо не выходило за пределы бумаги. Диод, включенный в проводящем направлении параллельно выходу интегратора, позволяет записывать сигналы, соответствующие максимальной активности, сохраняя достаточно большой коэффициент усиления схемы при сигналах, соответствующих минимуму активности тараканов. Кроме того, нелинейный выход интегратора обеспечивает дополнительное переключение муфты мотора (протяжки бумаги) в периоды необычно высокой и длительной активности. В конце периода наблюдения, перед гибелью насекомого, сопротивление его тела увеличивается, что приводит к уменьшению сигналов. Необходимо так откалибровать потенциометр интегратора, чтобы в этот период величина сигнала, поступающего на самописец, была прежней.

^* (Схема представляет собой выпрямитель с удвоением напряжения и последовательно включенный интегратор. - Прим. перев.)

Фиг. 4. Схема выпрямителя с удвоением напряжения. Выпрямленное напряжение интегрируется и поступает на нелинейный выходной элемент (см. текст)

Если под сосудом, усилителем, осциллографом и самописцем поместить слой алюминиевой фольги, то можно уменьшить до очень малого уровня помехи от сетей переменного тока. Провода от выхода интегратора к самописцу должны быть экранированными, так как, если частота и фаза сигналов меняется при работе переключателя, возможны ложные записи.

Регистрация двигательной активности

Для регистрации двигательной активности применялись совершенно иные методы. В этих опытах насекомые не закреплялись и электроды в них не вводились. Наилучшим методом наблюдения оказалось использование емкостного датчика. Прибор, усиливающий и преобразующий сигналы датчика, входит в стандартное лабораторное оборудование под названием реле "термокап". Выходное напряжение этого реле подается на самописец через миллиамперметр, переключенный на соответствующий предел измерений. При помощи делителя напряжения на входе самописца производится соответствующая настройка величины сигнала, чтобы перо не выходило за пределы бумаги и чтобы число переключений муфты было минимальным. Для устойчивости работы используется преобразователь постоянного напряжения. Этот прибор работает от сети и поэтому в целях безопасности должен иметь изоляцию. Преобразователи постоянного напряжения с изоляцией имеются в продаже.

Система наблюдения работает непрерывно в течение 50 дней без вмешательства человека (если не считать добавления чернил в самописец). Это характеризует устойчивость и надежность элементов системы. Типичные записи, полученные этим методом, приведены на фиг. 5.

Фиг. 5. Типичные записи двигательной активности таракана Leucophaea maderae, полученные с помощью емкостного датчика

Емкостный элемент, в котором находится насекомое, представляет собой стеклянный цилиндр с круглым пластмассовым диском, расположенным на высоте 15 см от дна. С наружной стороны, на высоте 10-15 см от дна, цилиндр обернут полоской алюминиевой фольги, прикрепленной изоляционной лентой (фиг. 6). Эта фольга соединяется с входом реле "термокап" при помощи короткого медного провода диаметром 0,2 мм. В нашем опыте вся аппаратура стояла на листе алюминиевой фольги, которая служила общей "землей" и второй пластиной конденсатора.

Фиг. 6. Установка для наблюдения за двигательной активностью таракана Leucophaea maderae (слева - емкостной датчик)

Реле "термокап" работало следующим образом: на сетку генераторной лампы подключались соединенные последовательно контурная катушка и переменный конденсатор (75 пф). Частота генератора составляла 250 кгц. Другой переменный конденсатор (3 пф) подключался между сеткой и землей. К сетке той же лампы присоединялась алюминиевая фольга, прикрепленная к стеклянному цилиндру. Оба переменных конденсатора настраивались так, чтобы поступающий на сетку сигнал был достаточен для поддержания генерации. Сигнал, снятый с катода лампы, выпрямлялся и подавался на RC-цепочку сетки выходной лампы. Это отрицательное напряжение приводило к смещению рабочей точки лампы в область отсечки. Увеличение емкости датчика, подключенной к сетке генераторной лампы, вызывало уменьшение сигнала (с частотой 250 кгц) на выходе генератора. При этом уменьшалось отрицательное смещение на сетке выходной лампы и возрастал ее ток. Одновременно увеличивался ток миллиамперметра и напряжение, поступающее на самописец. Когда таракан приближается к полоске фольги, прикрепленной к стеклянному цилиндру, то емкость увеличивается; при этом увеличивается ток через миллиамперметр и перо самописца движется вверх. Когда таракан возвращается на дно цилиндра, емкость уменьшается и перо самописца движется вниз. Переместив алюминиевую фольгу к дну цилиндра и уменьшив емкость переменного конденсатора, соединяющего сетку с землей, можно повысить чувствительность прибора. Другой способ повышения чувствительности - уменьшение емкости переменного конденсатора, включенного последовательно с контурной катушкой. При тщательной настройке возможна даже регистрация движения усиков таракана.

При использовании реле "термокап" перемещения таракана вызывают изменение емкости и сигнала обратной связи, поступающего на вход генератора, но не влияют на частоту. Для наблюдения за крупными насекомыми этот метод вполне пригоден. Но при изучении мелких насекомых применяются значительно более чувствительные приборы. При этом емкостной датчик включается последовательно с контурной катушкой. Изменения емкости датчика приводят к изменениям частоты генератора, которые выделяются детектором частотно-модулированных сигналов. С помощью емкостного датчика с близко расположенными пластинами можно регистрировать движения таких мелких насекомых, как, например, дрозофила.

Аппаратура, используемая в этих опытах, состояла из генератора колебаний частотой 100 Мгц и блока настройки частотно-модулированных сигналов, отрегулированного на центральную частоту. Частота генератора модулировалась емкостным датчиком. Выходной сигнал детектора поступал на самописец, предназначенный для сигналов до 50 мв. При отклонении частоты, вызванном перемещением насекомого, выходное напряжение детектора изменялось на несколько вольт. Небольшая часть этого напряжения поступала на самописец. При работе генератора имеется значительный дрейф частоты. Использование автоматической регулировки частоты местного генератора блока настройки могло бы, несомненно, обеспечить увеличение устойчивости генератора. При этом постоянная времени схемы автоматической стабилизации частоты должна быть достаточно большой, чтобы эта схема не вносила искажения в отклонения частоты, вызванные активностью насекомых. Можно также включить емкостной датчик в схему местного генератора приемника частотно-модулированных сигналов и использовать в качестве источника стабильных сигналов генератор с кварцевой стабилизацией частоты.

Другой метод регистрации двигательной активности состоял в использовании электромагнитной фокусирующей катушки телевизионной трубки. В тело тараканов вводили небольшие куски железной проволоки. При движении насекомых внутри катушки возникал сигнал в несколько милливольт, который можно было наблюдать на экране осциллоскопа, не прибегая к промежуточному усилителю и регистрации на самописце. Тараканы с железной проволокой жили в течение нескольких месяцев и поведение их не отличалось от нормального. В других опытах на брюшко таракана наносили смесь железной пудры (или пудры из окиси железа) с силиконовым резиновым лаком. Так же как и в предыдущем случае, получаемые сигналы были достаточны для непосредственного наблюдения на экране осциллоскопа.

Заключение

Хотя описанные нами схемы не новы и не впервые используются в биологических экспериментах, благодаря им мы решились на исследования, от которых нас Могла бы отпугнуть более сложная аппаратура. Большинство методов наблюдения за насекомыми, которые мы применяли в лаборатории, могут также найти применение при телеизмерениях (при соответствующей миниатюризации аппаратуры), в частности при посылке насекомых в космос на искусственных спутниках и ракетах. Однако осуществить настройку предлагаемых нами простых схем, возможно, труднее, чем настройку сложной аппаратуры, спроектированной специально для проведения телеизмерений.

Обсуждение доклада

Корсон. Я хотел бы знать, сравнивал ли д-р Датки поведение обездвиженных и свободных насекомых. Ведь у любого животного ограничение подвижности вызывает очень серьезные нарушения физиологии.

Датки. Это верно. В отличие от свободно перемещающихся тараканов, которые в период покоя совсем не движутся, тараканы с введенными электродами производят в этот период некоторые движения. Без сомнения, ограничение подвижности тараканов нарушает их нормальное поведение. Однако, несмотря на это, можно использовать введенные электроды для изучения реакций на отталкивающие вещества или вещества, привлекающие насекомое (например, вещества, привлекающие особей другого пола).

Брэнник. Д-р Робертс изучал поведение тараканов, домашних мух и дрозофил с помощью мегагерцового генератора, частота которого изменялась при перемещении насекомого. Выяснилось, что этот способ хорош для домашних мух, но не совсем пригоден для дрозофил. Насекомые содержались в довольно большом сосуде, где они свободно двигались и где поддерживалась определенная влажность, температура и состав воздуха и соблюдалось нормальное суточное чередование дня и ночи. Этим методом можно было бы с успехом изучать двигательную активность, ритмы и влияние состава воздуха на ритм.

Между прочим, Робертс пользовался простым генератором на одной лампе и дешевыми высокочастотными усилителями. При перемещениях насекомого изменялась частота.

Датки. Насекомое перемещалось между двумя пластинами?

Брэнник. Нет, внутри катушки. Катушка была намотана на пластмассовый ящик, в котором находилось насекомое.