20.11.2012

Немецкие биотехнологи создали из ДНК искусственные ионные каналы

Ионные каналы — это один из главных инструментов, с помощью которых клетка обменивается веществом с внешним миром. Эти сложные молекулярные устройства, подобно вахтерам на КПП, одновременно и анализируют молекулы, и контролируют поток частиц через клеточную мембрану. Немецкие ученые, создатели искусственной версии такого канала, считают, что их аналог может выполнять обе функции. Пропускную способность определяют параметры ионных каналов (форма, диаметр, заряд проходящей сквозь канал молекулы), и эти параметры можно менять по желанию исследователей. Аналитические возможности искусственных каналов, как было подтверждено серией экспериментов, тоже сравнимы с естественными: они надежно различают полимерные молекулы по длине и конфигурации, пишет Science.

Как известно, в двуслойную липидную мембрану клетки встроены белковые комплексы, которые помимо прочего контролируют поток разных молекул внутрь клетки и наружу. Пропуском могут служить и специфические молекулы, распознаваемые поверхностными рецепторами, и размер, и конфигурация, и заряд молекул. Часть таких мембранных комплексов именуется ионными каналами, через них заряженные частицы отправляются наружу или внутрь клетки. Все процессы, которые зависят от разности потенциала на мембране, — а таких очень много — основаны на работе ионных каналов. Любое живое существо зависит от своих ионных каналов: без них невозможны прохождение нервных импульсов (одного этого достаточно!), мышечные сокращения, водный обмен и многое другое. Исследованию принципов их действия и их классификации по функциям и строению посвящена заметная область науки физиологии.

И вот теперь биотехнологи дошли до того, что спроектировали и сделали работающий искусственный ионный канал. Их привлекала идея смоделировать канал с предсказуемыми свойствами. Создателями версии искусственных ионных каналов стали немецкие ученые из Мюнхенского технического университета и Мичиганского университета в Анн Арборе (США). Они решили уподобить свое творение природному каналу альфа-гемолизину — белку-токсину, выделяемому стрептококками и стафилококками. Это один из наиболее изученных канальных комплексов, его строение расшифровали первым, и устроен он проще других.

Механизм работы альфа-гемолизина таков. Как известно, концентрации различных ионов внутри и снаружи клетки сильно отличаются. Например, ионов калия много внутри клетки и мало снаружи, а ионов натрия, наоборот, много снаружи и мало внутри. Из-за этого возникает разность потенциалов между внутренней и наружной поверхностями клеточной мембраны — мембранный потенциал. На этот потенциал, как уже говорилось выше, «завязано» огромное количество происходящих в клетке процессов, например, с его помощью осуществляется транспорт через мембрану определенных веществ. Поэтому наличие мембранного потенциала совершенно необходимо для жизни клетки.

И вот некоторые патогенные бактерии (например, стрептококки и стафилококки) научились пользоваться тем, что при нарушении мембранного потенциала клетка погибает. Оказавшись возле клетки, эти бактерии начинают выделять белки, которые собираются в ионный канал — гемолизин — на клеточной мембране. Этот канал, в отличие от «добропорядочных» каналов нормальной мембраны, пропускает не строго определенные ионы в строго определенный момент, а все ионы подряд и постоянно (то есть, по сути дела, это не канал, а просто «дырка», пора). В результате концентрации ионов по обе стороны мембраны выравниваются, мембранный потенциал исчезает и клетка погибает. Наиболее уязвимы для таких атак красные клетки крови, эритроциты, и, собственно, поэтому гемолизин (в переводе с греческого ‘растворяющий кровь’) и получил свое название.

Конечно, ученым канал нужен не для убийства клеток. Такой канал, подобно демону Максвелла, позволил бы отсортировывать на одной стороне мембраны только строго определенные молекулы. А уж использовать подобное свойство можно по-всякому.

Альфа-гемолизин состоит из семи (шести-восьми) белковых субъединиц, которые формируют полый бочонок. Этот бочонок прикрепляется к мембране гидрофобным донцем. К донцу присоединена трубка из остатков лизина и глутамата, она-то и проходит сквозь мембрану. Диаметр внутреннего отверстия трубки 2,2 нм, в самой узкой части прикрепления к донцу — около 1,5 нм. Примерно такую же по форме структуру, но только в основе своей из ДНК, смоделировали немецкие биотехнологи.

ДНК в данном случае оказалась очень удобной молекулой. Задав первичную структуру молекулы (то есть последовательность нуклеотидов), можно предсказать и вторичную и третичную ее структуру. Иными словами, получить молекулу заданной формы и размера.

В отличие от белков, для которых известно двадцать мономеров — аминокислот, между которыми существуют сложные отношения (каждая возможная пара аминокислот может сильно или слабо притягиваться или отталкиваться в зависимости от заряда, растворимости в воде и жирах и так далее), — ДНК образована всего четырьмя нуклеотидами, отношения между которыми просты: аденин соединяется с тимином, а гуанин — с цитозином. Поэтому создать из нескольких одноцепочечных отрезков ДНК пространственный комплекс с заданными свойствами легко — это всё равно что делать модели из спичек. Там, где «спички» (то есть отрезки ДНК) должны быть соединены, надо поставить «скрепки» — короткие олигонуклеотидные отрезки, комплементарные нужным участкам «спичек». При этом ДНК-«спички» куда интереснее в пространственном отношении, чем обычные деревянные спички: если их скрепить определенным образом, они могут изогнуться и сообщить итоговой трехмерной структуре еще более сложную форму. Конечно, всё не так просто, и надо всегда просчитывать структуру комплекса так, чтобы друг с другом не соединилось что-нибудь лишнее. Однако при правильном использовании данная методика (известная также как «ДНК-оригами») позволяет создавать довольно сложные трехмерные комплексы с заданными свойствами.

И в данной работе это с успехом было проделано. Исследователи создали искусственный ДНК-оригамный канал (рис. 1), основные характеристики которого совпадали с таковыми для альфа-гемолизина: диаметр поры составлял 2 нм, длина около 47 нм, сила ионного потока 0,87. Канал сначала сам себя строил на мембране, а затем, укрепившись, начинал проводить ионный ток через мембрану. Ток через единичный канал, как и предполагалось, был более или менее постоянным.

Так же, как и клеточные ионные каналы, искусственные аналоги могли пропускать одноцепочечные ДНК с одной стороны мембраны на другую. При проходе молекулы ДНК через канал отверстие закрывается и ток блокируется. Поэтому о прохождении молекул через поры судят по характерной картине скачков силы тока: момент прохождения крупной молекулы через канал на развертке тока выглядит как локальный минимум. Чем больше на проходящей молекуле запутанных петель и прикрепленных остатков, тем дольше время блокировки тока и тем меньше времени канал открыт. Для каждого из исследованных видов молекул ученые зафиксировали свою специфическую картину прохождения через канал (рис. 2). Это значит, что с помощью искусственных ионных каналов можно анализировать молекулы в растворе.

А если в структуру строительной ДНК внести небольшие изменения? Конечно, изменения должны быть такие, какие задумал исследователь, пожелавший получить другие пропускные способности канала. Действительно, моделируя петли в структуре строительных блоков ДНК, ученые получили каналы с заданными характеристиками (рис. 3).

Ясно, что конструирование искусственных ионных каналов — это область будущих технологий. Предполагается, что подобные наноустройства станут не только перспективными молекулярными анализаторами, но и лекарственными агентами с широчайшей областью применений. Остается надеяться, что это будущее не очень отдаленное, здесь наука развивается прямо-таки c космической скоростью. Вот, например, забавная ремарка из статьи: «В прошлом было показано, что наноразмерные мембранные поры потенциально могут оказаться исключительно полезными мономолекулярными биосенсорами» (и далее несколько ссылок на литературу). Если судить по этим ссылкам, то «прошлым» авторы работы считают 2001–2010 гг. Прошлое стремительно уносится, но так же стремительно приближается будущее.

Источники:

1. elementy.ru