12.03.2013

Прокариотическая система иммунитета поможет редактировать геном

Хотя прокариоты — это одни из самых просто организованных существ на Земле (проще устроены только вирусы), их устройство поражает своим изяществом и совершенством. Например, недавно в научном мире буквально совершило переворот открытие прокариотических CRISPR-систем, которые обеспечивают приобретенный иммунитет к вирусам и плазмидам. О работе этих систем и о том, что их изучение может дать человечеству, рассказал в своей лекции на Зимней школе FutureBiotech доктор биологических наук Константин Викторович Северинов.

Загадочные участки генома

В конце 1980-х годов в ходе первых попыток секвенирования генома кишечной палочки японские исследователи обнаружили нечто удивительное — участки ДНК, содержащие множественные идентичные повторы, разделенные неидентичными, уникальными участками — спейсерами (рис. 1, 2). Подобные участки стали обнаруживать и в других прокариотах. После череды промежуточных имен их в конце концов назвали CRISPR — Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, сгруппированные регуляторные разделенные промежутками короткие палиндромные повторы. Они есть примерно у 40% бактерий и почти у всех архей.

Функция CRISPR долгое время оставалась неясной. Однако практическая польза от CRISPR была получена и без понимания их роли: поскольку набор спейсеров уникален для каждого штамма, то с их помощью можно идентифицировать штаммы; на этом, например, основан метод сполиготипирования микобактерий туберкулеза, широко применяемый в эпидемиологии для идентификации источника возбудителя и определения очага инфекции.

Но для чего нужны эти загадочные CRISPR самим клеткам? То, что они так широко распространены в прокариотическом мире, означало, что они делают что-то очень важное, что необходимо почти всем прокариотам. Но что? Этого никто не знал.

Разгадка могла таиться в нуклеотидной последовательности CRISPR и особенно в последовательности уникальных, не повторяющихся участков — спейсеров. Увы, до определенного времени исследования этих коротких нуклеотидных последовательностей не давали никаких результатов. Казалось, что спейсеры кодируют какую-то абракадабру, которая ничему не соответствует, ничего не определяет и ни для чего не нужна.

И вот около десяти лет назад обнаружилась одна любопытная и странная вещь. Оказалось, что последовательности спейсеров данного вида прокариот подозрительно часто совпадают с последовательностями геномов вирусов, которые поражают этот вид. Такое удивительное совпадение говорило о том, что CRISPR-система — это что-то вроде прокариотического приобретенного иммунитета, который позволяет запомнить врага и справиться с ним при повторном заражении. Приятно отметить, что важную роль в разгадке функции CRISPR сыграл наш бывший соотечественник Евгений Кунин.

CRISPR-система: приобретенный иммунитет прокариот

В настоящее время известно несколько типов CRISPR-систем. Рассмотрим вначале работу CRISPR системы, характерную для кишечной палочки Esherichia сoli.

При транскрипции CRISPR-кассеты получаются короткие некодирующие РНК — crРНК, каждая из которых состоит из спейсера, окруженного двумя участками повтора (рис. 1). Если клетку заражает вирус, последовательность ДНК которого комплементарна последовательности спейсера одной из crРНК, то клетка сможет пережить инфекцию.

Спейсер crРНК с помощью комплекса особых Cas-белков, который называется Cascade, присоединяется к комплементарному участку вирусной ДНК — протоспейсеру (для этого необходимо еще, чтобы перед протоспейсером в чужеродной ДНК находилась коротенькая нуклеотидная последовательность — PAM, protospacer associated motif). После этого к образовавшемуся комплексу подплывает еще один cas-белок — Cas3, эндонуклеаза/хеликаза, которая вносит в ДНК вируса двуцепочечный разрыв (рис. 3, B). В результате чужеродная ДНК оказывается повреждена, вирусная инфекция прекращается, а клетка «одерживает победу» и остается в живых.

Примерно так же устроена и работа CRISPR-системы другого типа, характерной, например, для бактерии Streptococcus thermophilus, используемой для производства многих молочнокислых продуктов, однако компонентов в ней меньше и устроена она проще. Созревание crРНК обеспечивается короткой некодирующей РНК (trans-activating crRNA или tracrРНК), комплементарной участку повтора, и широко распространенным клеточным ферментом РНКазой III, а также вспомогательным белком Csn1 (рис. 2). Атака на чужеродную ДНК производится с помощью той же tracrРНК и эндонуклеазы Cas9 (рис. 3, А).

Прокариотическая CRISPR-система защиты от вирусов очень похожа на эукариотическую систему РНК-интерференции, которая также участвует в антивирусной защите и использует для этого примерно тот же прием — присоединение к нежелательной мРНК короткого комплементарного РНК-участка и последующее выключение этой ненужной мРНК тем или иным способом (например, ее можно просто разрезать на кусочки).

Часто crРНК ухитряются связаться даже с не полностью комплементарной последовательностью ДНК вируса, при условии что имеется подходящий PAM-участок и начало протоспейсера полностью комплементарно последовательности спейсера (рис. 4). Таким образом, один спейсер может одновременно обеспечивать защиту против нескольких сходных вирусов. Это удобно и позволяет сэкономить место в маленьком прокариотическом геноме.

Однако что же делать, если клетка никогда прежде не встречалась с данным вирусом и не имеет crРНК с узнающим его спейсером? Неужели она обречена? Неужели вирус в этом случае одержит победу?

Не совсем так. Конечно, большая часть «наивных» бактерий будет уничтожена вирусом. Однако некоторые клетки ухитрятся с ним справиться — и вот каким образом (рис. 5): зараженные вирусом бактериальные клетки начинают лихорадочно вырезать все попавшиеся под руку (точнее — под фермент) участки ДНК и вставлять их в CRISPR-кассету в качестве спейсеров (важную роль в этом процессе играют еще два Cas-белка — Cas1 и Cas2).

Большая часть вставленных участков окажется бесполезной или даже вредной (например, вставка в качестве «портрета врага» участка бактериальной ДНК приведет к гибели клетки за счет раскуса собственной ДНК); однако некоторые «счастливчики» случайно вставляют в качестве CRISPR-спейсера фрагмент вирусной ДНК, что дает возможность синтезировать защитную crРНК и победить вирус. Этот новый спейсер они передадут всем своим потомкам, и поэтому от данного вируса их потомки будут защищены. Вообще, набор спейсеров в данной клетке — это, в каком-то смысле, ее история, память о прежних, выигранных, боях с вирусами.

Но это еще не всё. Оказывается, вставка спейсеров происходит по принципу положительной обратной связи, то есть вставка одного спейсера резко стимулирует вставку последующих спейсеров из ДНК донора. Так, эксперименты, проведенные в лаборатории К. В. Северинова, показали, что, если у данной бактерии есть спейсер к данному вирусу, повторное заражение этим вирусом вызывает направленную вставку дополнительных спейсеров из ДНК вируса. Иными словами, если бактерия уже атаковалась раньше вирусами, то следующие атаки она перенесет легче, потому что у нее будет способность идентифицировать чужеродную ДНК и вставлять новые спейсеры. Чем-то похоже на вакцинацию, правда?

Практическое применение

Какую же практическую пользу можно извлечь из знаний о работе CRISPR-системы? Огромную, и во множестве областей.

Начнем с того, что прокариотические клетки активно используются людьми для самых разных вещей: возьмем хотя бы всем известные кисломолочные бактерии. Понятно, что одна из самых ужасных вещей, которая может случиться при производстве кисломолочных продуктов, — это атака бактериофагов, уничтожающих бактериальную культуру. Однако если мы знаем, как защитить бактерии от этой атаки, то проблем с производством кисломолочных продуктов не будет.

В то же время, другие бактерии, наоборот, могут нанести человеку, животным или растениям серьезный вред. Однако если мы знаем, как они защищаются от атак бактериофагов, то можем помешать им это делать и так спастись от бактериальной инфекции.

Наконец, есть еще третье, на редкость перспективное, применение CRISPR-системы. С ее помощью можно с невиданной доселе аккуратностью редактировать геномы высших организмов, включая человека. Об этом недавно вышли две статьи в Science (Le Cong et al., 2013. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems; Prashant Mali et al., 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9), и на этом я остановлюсь поподробней.

Самые точные ножницы для генома

Для того чтобы «отредактировать» какое-то место в ДНК, например, исправить мутацию, приводящую к генетическому заболеванию, надо сначала это место разрезать. При этом разрезающий фермент — эндонуклеаза — должен обладать высочайшей специфичностью, то есть резать ДНК в нужном месте и только в нем (потому что разрезание ДНК в ненужном месте может привести к совершенно ненужным последствиям). А значит, участок ДНК, по которому распознается это нужное место, должен быть как можно длиннее — ведь чем он длинней, тем меньше вероятность, что такой же участок встретится где-то еще на просторах генома и что там тоже пройдутся «ножницы» эндонуклеазы.

Так как защитный комплекс CRISPR-систем связывается с относительно длинными (не меньше 20 нуклеотидов) участками ДНК, соответствующими спейсерам, то возникает возможность достичь высокой специфичности редактирования.

За основу своей разработки обе группы авторов опубликованных в Science статей взяли просто устроенную систему из Streptococcus thermophilus, состоящую всего из четырех обязательных элементов — tracrРНК, crРНК, РНКазы III и Cas9 (рис. 3, А). Чем меньше компонентов, тем проще работать с системой и тем выше шанс, что система заработает в нестандартных для себя условиях работы в эукариотической клетке. Исследователям удалось еще более упростить систему. Во-первых, они создали «химерную» tracr-crРНК, которая работала ничуть не хуже, чем tracrРНК и crРНК, синтезируемые по отдельности (рис. 6). Во-вторых, они обнаружили, что бактериальная РНКаза III для работы системы не обязательна, поскольку ее функцию могут выполняют «местные» РНКазы, синтезируемые в эукариотической клетке.

Таким образом, для того чтобы разрезать в клетке ДНК в нужном месте, нужно было сделать совсем немного:

1) Поставить последовательность, комплементарную этому «нужному месту», в качестве спейсера в CRISPR-кассету и получить химерную tracr-crРНК.

2) Запустить экспрессию этой CRISPR-кассеты и белка Cas9 в соответствующей клетке, снабдив их сигналом ядерной локализации (NLS), чтобы они не «слонялись без толку» по цитоплазме, а плыли прямо в ядро, где, собственно, и находится разрезаемая ДНК.

Получившаяся система в работе на клеточных культурах показала отличные результаты: с ее помощью можно как удалять из ДНК какие-то участки, так и вставлять туда новые области. CRISPR-система показала лучшую эффективность, чем предыдущие «фавориты» в этой области — цинковопальцевые нуклеазы и TALEN. Нельзя, конечно, говорить о том, что CRISPR-система позволит делать с геномом всё, что только захочется исследователю, но, пожалуй, из всех существующих методик она наиболее близка к этому.

Вера Башмакова

Источники:

1. elementy.ru