11.02.2013

Мобильная ДНК заставляет бактерии жертвовать собой

Горизонтальный перенос ДНК (то есть обмен молекулами ДНК между клетками) широко распространен среди бактерий и играет огромную роль в их эволюции. Ученые из Университета Лозанны (Швейцария) на примере двух видов бактерий из рода Pseudomonas уточнили механизм передачи мобильной ДНК от клетки к клетке. Они проследили, в каких условиях бактерии передают друг другу фрагменты хромосом, содержащие целые группы генов, ответственные за определенный процесс, — так называемые «геномные островки». Для передачи такого элемента необходима активация фермента интегразы, который осуществляет вырезание соответствующего куска ДНК. Фермент случайным образом включается только у 3–5% бактерий в популяции. Клетки, в которых он включился, плохо делятся и часто погибают. Они формируют специфические маленькие колонии, хорошо отличимые от колоний, образуемых нормальными клетками. Такую дифференцировку обеспечивает ген, названный shi («смерть»), содержащийся в геномном островке. Таким образом, мобильная ДНК сама контролирует условия своей передачи, пишет Current Biology.

Бактерии обладают огромным разнообразием фенотипов, что позволяет им жить практически где угодно. Это разнообразие обеспечивается способностью бактерий передавать куски ДНК, а вместе с ними и генетическую информацию непосредственно от клетки к клетке. Такой способ передачи информации называется горизонтальным переносом генов, в отличие от вертикального переноса, подразумевающего передачу от предков к потомкам. Используя способность к горизонтальному переносу, клетка может поделиться с клеткой-соседкой геном, придающим устойчивость к антибиотику, или свойства вирулентности, или способность метаболизировать новое вещество. Бактерии могут осуществлять не только внутривидовой обмен информацией, но и обмен между разными видами. Таким образом, горизонтальный перенос играет огромную роль в эволюции бактерий. По оценкам, в геномах разных видов бактерий от 5 до 30% генетической информации появилось в результате горизонтального переноса. Возможен даже перенос генов от бактерий к эукариотам — например, агробактерии могут передавать плазмиды растениям).

К счастью для нас, не каждая бактерия может передать или принять ДНК и не всякий фрагмент ДНК может подвергнуться горизонтальному переносу, иначе бактерии очень быстро научились бы метаболизировать всё вокруг, в том числе антибиотики. Способность бактерий к горизонтальному переносу генов определяется как молекулярными механизмами, так и особенностями экологии того или иного вида.

Путей переноса генов существует несколько. Так, части бактериальной ДНК могут захватываться вирусами-бактериофагами и распространяться вместе с ними. Например, бактериофаги, инфицирующие морские сине-зеленые водоросли, могут переносить даже гены белков аппарата фотосинтеза.

Бактерии могут делиться друг с другом плазмидами — небольшими свободно плавающими в цитоплазме кольцевыми молекулами ДНК, которые в дополнение к бактериальной хромосоме кодируют белки, обеспечивающие различные адаптивные признаки. Передача плазмидной ДНК осуществляется в основном при контакте двух бактериальных клеток в процессе конъюгации. Соответственно, плазмиды, которыми обмениваются бактерии, называются конъюгативными. Важной особенностью плазмид является их способность реплицироваться, то есть создавать дочерние копии на матрице исходной молекулы.

Многие виды бактерий способны поглощать экзогенную ДНК — этот процесс называется трансформацией. Свободная ДНК может попасть в среду в результате лизиса, то есть гибели окружающих клеток. Некоторые виды способны выделять ДНК в среду активно при участии специальных белков.

Подробнее про горизонтальный перенос генов и способы, которыми он осуществляется, также можно прочитать в обзоре С. В. Шестакова «Как происходит и чем лимитируется горизонтальный перенос генов у бактерий» (PDF, 288 Кб).

Перенос генетической информации внутри клетки осуществляют инсерционные последовательности и транспозоны. Первые кодируют только ферменты, необходимые для собственного копирования и встраивания, однако они могут привести к изменениям работы того или иного гена в результате встраивания в кодирующую или регуляторную область. Транспозоны — мобильные элементы генома, которые могут вырезаться, реплицироваться и встраиваться обратно в других местах (часто в нескольких копиях); они перемещаются как целостная структура. Разновидностей транспозонов очень много, и помимо аппарата для собственного размножения они могут содержать и что-то полезное для клетки. Особой разновидностью являются так называемые интегративные конъюгативные транспозоны (integrating and conjugative elements, ICE). Эти мобильные фрагменты ДНК могут быть переданы другой клетке. Для этого они при определенных условиях выщепляются из генома клетки-хозяина (осуществляется ферментом интегразой), затем выщепленный участок закольцовывается, передается клетке-реципиенту путем конъюгации и встраивается не куда попало, а только по специфичным сайтам в геном реципиента путем сайт-специфичной рекомбинации. Эти фрагменты довольно большие и могут содержать большое количество генов.

Когда ICE-элемент (конъюгативный транспозон) встраивается в геном, он образует «геномный островок» — участок бактериального генома, содержащий целую группу генов, необходимую для какого-либо процесса (например, если эти гены необходимы для патогенеза, образуется так называемый «островок патогенности»). Геномные островки при анализе бактериального генома довольно заметны, так как они чужеродного происхождения и отличаются по составу от окружающей их ДНК (в них больше содержание GC-пар). Иногда они теряют способность передаваться другим клеткам.

Хорошо изученные геномные островки, обладающие свойствами ICE-элементов, описаны у Vibrio cholerae (возбудителя холеры), Haemophilus influenza (вызывает гемофильную инфекцию: бронхиты, менингиты и т. п.) и др.

Группа ученых из Университета Лозанны (Швейцария) изучает свойства ICE-элементов у широко распространенных бактерий из рода псевдомонад (Pseudomonas), обитающих в почве. В хромосоме у этих бактерий есть геномный островок, обладающий свойствами ICE-элемента. Так как он содержит гены ферментов метаболизма некоторых ароматических веществ, в том числе хлорокатехола (chlorocatechol), его обозначают как ICEclc (см.: Marco Minoia et al., 2008. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas). Он расположен после гена тРНК для аминокислоты глицина.

Процесс переноса ICEclc начинается с активации промотора гена интегразы (промотор — это регуляторный элемент гена, ответственный за его «включение»). Ранее на примере бактерии Pseudomonas knackmussii было показано, что интеграза активируется только в небольшой фракции клеток, причем это происходит в стационарной фазе роста, когда питательные вещества в среде исчерпаны и рост популяции прекращается. Для ее активации необходим белок InrR (integrase regulator) — регулятор интегразы (см.: Marco Minoia et al., 2008. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas). Он также синтезируется только в некоторых клетках в небольшом количестве. Что определяет включение этих генов в клетках в составе популяции, неясно. Предполагается, что включение InrR и, соответственно, активация интегразы происходят стохастически (случайным образом) в результате некоторого «транскрипционного шума» в регуляторной области inrR.

В своей новой статье авторы проследили за судьбой отдельных клеток и процессом передачи ICEclc с помощью эпифлуоресцентной микроскопии с замедленной съемкой и показали, что клетки, в которых произошла активация интегразы, ведут себя иначе, чем остальные.

В эксперименте использовали два вида бактерий — Pseudomonas knackmussii в качестве донора ICEclc и Pseudomonas putida в качестве реципиента. Для того чтобы зафиксировать факт передачи ДНК, в геном бактерий были внесены некоторые изменения (рис. 1). Донорные клетки были помечены красным флуоресцентным белком (mCherry) путем встраивания копии кодирующего его гена в геном бактерий. Так как P. knackmussii содержит две копии ICEclc, в одной из них интегразу заменили на ген зеленого флуоресцентного белка (egfp) под контролем промотора интегразы (Pint). Таким образом получилось, что красный белок синтезировали все клетки P. Knackmussii, а зеленый — только те, в которых активировалась интеграза. В результате наложения красного и зеленого активные доноры под микроскопом выглядят желтыми. Клетки-реципиенты содержали ген зеленого белка, перед которым не было регуляторного элемента, то есть сам по себе он не работал. Однако интегрируемый фрагмент ДНК содержал регуляторную область, поэтому, если интеграция ICEclc происходила, он начинал светиться (рис. 1, 2).

В результате эксперимента исследователи подтвердили, что только небольшая часть клеток в популяции (3–5%) может передавать генетическую информацию. Реципиенты могут получать ДНК только при прямом физическом контакте с активными донорами. Однако способность передавать ДНК не приносит клеткам пользы. Активация ICEclc приводила к тому, что клетки при помещении на свежую питательную среду делились редко или вообще не делились и часто погибали. Клетки с активной интегразой формировали отдельные микроколонии, хорошо отличимые от колоний нормальных клеток.

Изучив последовательность ДНК ICEclc, авторы обнаружили ген, ответственный за формирование микроколоний. Введение этого гена в клетки P. putida, не содержащие ICEclc, вызывало значительное замедление их роста. Ген назвали shi, что на японском означает «смерть». Клетки, получившие копию shi, имели характерную вытянутую форму и формировали на питательной среде микроколонии. После делеции этого гена из ICEclc интеграза в клетках по-прежнему могла активироваться и клетки могли передавать ДНК, однако процесс передачи происходил в пять раз реже.

Почему же носители активного ICE-элемента плохо себя чувствуют и редко делятся? Предполагается, что подготовка к процессу конъюгации требует от этих клеток большого количества ресурсов, которых негде взять в условиях истощенной среды, поэтому им буквально приходится занимать ресурсы у себя. Таким образом, клеткам приходится соблюдать баланс между самосохранением и эффективностью горизонтального переноса, которую обеспечивает «смертельный» ген shi. Функции этого гена пока неясны, однако понятно, что без него передача ДНК затруднена и что он портит клеткам жизнь.

Феномен разделения популяции бактерий на две субпопуляции при горизонтальном переносе генов известен у вида Bacillus subtilis, однако он связан с трансформацией, а не с передачей мобильной ДНК. У бактерий рода Enterococcus известно явление «готовности к передаче ДНК» (transfer competence), когда клетки, которые хотят получить плазмиду, стимулируют потенциальных доноров с помощью пептидных феромонов, но клеточной дифференциации при этом не наблюдается. Однако так как элементы, подобные ICEclc, часто встречаются в бактериальных геномах, явление дифференциации клеток для горизонтального переноса наверняка широко распространено. Описанный механизм заставляет вспомнить о концепции «эгоистичного гена» — мобильная ДНК буквально контролирует поведение клетки-хозяина, заставляя его идти на жертвы ради своего распространения.

Дарья Спасская

Источники:

1. elementy.ru