01.02.2013

Как построить белковую карту клетки

Понять, как работает клетка, невозможно без представления о том, где в ней находится тот или иной белок или другая биологическая макромолекула. Если учесть, что белков и других макромолекул в клетке тысячи и тысячи, задача кажется невыполнимой. Однако исследователям из Массачусетского технологического института (США), похоже, удалось её решить.

Метод, разработанный специалистами МТИ при участии учёных из Гарварда (США), представляет собой, по сути, нечто среднее между двумя другими способами — микроскопией и масс-спектрометрией. Современная микроскопия позволяет определить «прописку» белка в клетке, причём с довольно высоким разрешением, однако это можно сделать лишь в отношении очень немногих белков. Протеомную белковую карту клетки, которая учитывала бы местонахождение почти 20 тысяч белков, с помощью одного лишь микроскопа (электронного или флюоресцентного) получить нельзя. С другой стороны, масс-спектрометрия позволяет досконально узнать, что именно содержится в клетке. Но с целой, неповреждённой клеткой она не работает. Можно, конечно, выделить из клетки какую-нибудь часть — например, митохондрию — и таким образом определить, находится ли белок здесь или где-то ещё. Но этот способ трудоёмок и не вполне точен.

Исследователи нашли довольно изящное решение: они предложили снабжать белки особой меткой до того, как клетка пойдёт на масс-спектрометрию. По этой метке даже в смеси можно было бы определить, где до этого находилась белковая молекула. В качестве метки учёные выбрали биотин, а чтобы присоединять биотин к белкам, создали специальный фермент АРЕХ, представляющий собой модификацию одной из пероксидаз. Субстратом фермента был фенолбиотин, который с помощью АРЕХ превращался в свободный биотинфенольный радикал. Этот радикал, в свою очередь, мог уже сам присоединиться к любому белку. Обычно такие метки используют в микроскопии: метка светится, и в микроскоп можно увидеть, в какой части клетки находится белок. Тут метка служит примерно той же цели, но для масс-спектрометрии.

То есть в клетку вводят ген с пероксидазой АРЕХ, затем клетку заливают фенолбиотином, который навешивается на белки. Но в таком случае у фермента тоже должна быть определённая «прописка», иначе все клеточные белки получат метку. Для этого фермент гибридизуют с белком или пептидом, о котором уж точно известно, где он находится. То есть если мы хотим узнать белковый состав митохондрии, то АРЕХ направляется туда с помощью заведомо митохондриального пептида, который больше нигде в клетке не встречается. А уж оказавшись на месте, фермент обеспечит все близлежащие белки биотиновой меткой. За пределы митохондрии метка не выйдет, так как радикалы вообще в свободном виде живут недолго, мгновенно реагируя с тем, кто ближе.

С помощью этого метода, как пишут исследователи в Science, удалось определить 500 белков митохондриального матрикса. Предыдущие попытки выяснения белкового состава матрикса предполагали выделение митохондрий из клетки с последующим анализом обычной масс-спектрометрией: таким способом удавалось определить в лучшем случае около 37 белков. Разница очевидна. Более того, удалось даже скорректировать ошибочные сведения о местонахождении некоторых белков. Что, разумеется, заставит по-новому взглянуть на некоторые биохимические процессы.

Сейчас учёные работают уже над следующей задачей: теперь они хотят узнать, какие белки находятся в пространстве между внутренней и внешней мембраной митохондрий. Оптимизм по поводу возможностей нового метода велик: по мнению некоторых, с его помощью можно будет решать даже более тонкие задачи — например, увидеть топографию белков на мембране. Хотя «увидеть» в данном случае нельзя понимать буквально: при всех достоинствах метода, он выглядит не столь эффектно, как традиционная флюоресцентная микроскопия, когда мы наблюдаем разноцветные пятна в клетке собственными глазами. Впрочем, науку внешняя эффектность должна волновать в последнюю очередь, не так ли?

Кирилл Стасевич

Источники:

1. КОМПЬЮЛЕНТА