10.02.2014

Простая система межклеточной коммуникации обеспечивает разнообразное коллективное поведение

Эксперименты на генетически модифицированных дрожжах показали, что разнообразные формы коллективного поведения клеток могут порождаться простой системой межклеточной коммуникации, основанной на том, что одни и те же клетки и производят химический сигнал, и реагируют на него. Поведение такой системы зависит от того, отвечает ли клетка преимущественно на свои собственные сигналы или на сигналы клеток-соседей, а это, в свою очередь, определяется плотностью клеточной популяции, скоростью производства сигнального вещества и чувствительностью клеток к нему. Полученные результаты проливают свет на столь разные биологические явления, как «чувство кворума» у микробов и избирательное размножение Т-лимфоцитов в ходе иммунного ответа.

Межклеточное общение посредством химических сигналов играет ключевую роль в развитии многоклеточного организма и в коллективном поведении одноклеточных. При этом сплошь и рядом бывает так, что клетка выделяет в окружающую среду сигнальное вещество, на которое сама же и реагирует. Это называют аутокринной регуляцией.

Зачем нужны такие «разговоры вслух с самим собой»? Казалось бы, если перед клеткой стоит только задача саморегуляции, ей было бы проще и дешевле «думать про себя», то есть обойтись внутриклеточной сигнальной системой, а не выводить сигнальное вещество наружу. Очевидно, преимущество разговоров вслух заключается в том, что их могут услышать посторонние, в данном случае — другие клетки, имеющие рецепторы к этому сигнальному веществу.

Именно на таких системах химической коммуникации, когда клетки выделяют вещество, на которое сами же и реагируют, основано коллективное поведение бактерий (см. Quorum sensing), работа бета-клеток поджелудочной железы, которые одновременно производят инсулин и реагируют на него, размножение Т-лимфоцитов, регулируемое интерлейкином-2, который производится самими Т-лимфоцитами, и многие другие саморегулирующиеся процессы. При этом иногда сигнальное вещество, произведенное клеткой, влияет прежде всего на нее саму (самокоммуникация), иногда — на другие клетки (коммуникация с соседями), а иногда оба вида коммуникации работают одновременно (рис. 1).

Чтобы оценить возможности сигнальных систем, основанных на принципе «secrete and sense» (то есть на производстве сигнального вещества клетками, чувствительными к этому веществу), и понять, почему эти системы так широко распространены в природе, биологи из Калифорнийского университета в Сан-Франциско провели серию экспериментов на генетически модифицированных дрожжах.

Прежде всего, нужно было научиться различать и количественно оценивать самокоммуникацию и коммуникацию с соседями. Но как определить, реагирует ли клетка на вещество, произведенное ею самой, или на точно такое же вещество, произведенное другими клетками? Для решения этой задачи авторы сконструировали два штамма дрожжей, один из которых умел и производить сигнальное вещество, и реагировать на него, а второй мог только реагировать, а производить не мог.

Первый штамм они назвали secretе and sense («производи и чувствуй»). Эти дрожжевые клетки производят альфа-фактор (половой феромон) и сами же на него реагируют при помощи мембранного рецептора Ste2. Геном дрожжей модифицировали так, чтобы альфа-фактор не стимулировал половой процесс (как у нормальных дрожжей), а активировал синтез зеленого флуоресцирующего белка (green fluorescent protein, GFP). Таким образом, по количеству GFP, производимого клеткой, исследователи могли судить о силе реакции на альфа-фактор. Кроме того, ген MFα1, кодирующий альфа-фактор, был помещен под управление промотора, активируемого доксициклином. Это позволило регулировать производство клетками альфа-фактора, просто меняя концентрацию доксициклина в среде.

Второй штамм назвали sense only («только чувствуй»). Он отличается от первого отсутствием способности производить альфа-фактор (у него удален ген MFα1), а также постоянно работающим геном красного флуоресцирующего белка. Последняя особенность позволяет различать клетки sense only и secret and sense в смешанной культуре.

Оба штамма были изготовлены в нескольких вариантах, различающихся уровнем экспрессии рецептора Ste2, от которого зависит чувствительность к альфа-фактору.

Идея в том, что если поведение дрожжевых клеток определяется коммуникацией с соседями, то в смешанной культуре клетки обоих штаммов должны производить одинаковое количество GFP. Они будут реагировать на общую концентрацию альфа-фактора в среде, а кто именно произвел этот феромон — неважно. Но если окажется, что клетки secret and sense светятся ярче, это будет означать, что они реагируют на феромон, произведенный ими самими, то есть налицо будет «разговор с собой».

Смешанные культуры двух штаммов тестировались при разной плотности клеток и разной концентрации доксициклина (которая, напомним, определяет скорость производства альфа-фактора). Используя клетки с разным уровнем экспрессии рецептора Ste2, авторы манипулировали еще и третьим параметром — чувствительностью клеток к альфа-фактору.

Как выяснилось, при высокой плотности популяции дрожжи обоих штаммов производят одинаковое количество GFP независимо от скорости синтеза альфа-фактора и чувствительности клеток к нему. Это значит, что в системе преобладает коммуникация с соседями, а самокоммуникация не играет существенной роли. Очевидно, при высокой плотности клеток концентрация альфа-фактора оказывается высокой во всей толще среды, и поэтому то, выделяет ли данная клетка альфа-фактор сама или только реагирует на «чужой» феромон, не влияет на ее поведение.

При низкой плотности клеток ситуация оказалась иной. В этом случае всё зависит от двух других параметров: интенсивности производства альфа-фактора и чувствительности к нему. Если чувствительность клеток невысока и (или) клетки синтезируют альфа-фактор медленно, то преобладает коммуникация с соседями: штаммы secret and sense и sense only производят одинаковое количество GFP. Однако в случае интенсивного производства альфа-фактора и высокой чувствительности к нему на первый план выходит самокоммуникация. Это проявляется в том, что дрожжи secret and sense производят значительно больше GFP, чем sense only (рис. 2).

Дело в том, что вокруг клеток, производящих альфа-фактор в больших количествах, образуется область повышенной концентрации феромона, который не успевает диффундировать, а вместо этого быстро связывается с многочисленными рецепторами Ste2, сидящими на поверхности той самой клетки, которая его произвела.

Можно сказать, что при низкой плотности дрожжи secret and sense, производящие много феромона и имеющие много рецепторов к нему, являются «асоциальными»: они общаются в основном сами с собой. Если же клетка производит феромон медленно или имеет мало рецепторов Ste2, то молекулы феромона успевают разбежаться по окружающей среде и влияют на все соседние клетки примерно в одинаковой степени. Такие клетки можно условно назвать «социальными», потому что сигнальное вещество, которое они производят, воспринимается не только ими самими, но и всеми соседями.

Авторы не остановились на достигнутом и усложнили свою экспериментальную систему, добавив в нее положительную обратную связь. Для этого они изменили геном дрожжей secrete and sense таким образом, чтобы уровень производства альфа-фактора зависел не от доксициклина, а от самого альфа-фактора. Что касается доксициклина, то он теперь регулировал силу этой положительной обратной связи, то есть то, в какой степени повышение концентрации феромона будет ускорять его производство. В результате получились дрожжи, у которых система синтеза альфа-фактора может находиться в одном из двух дискретных состояний: «включено» (альфа-фактор синтезируется по максимуму, стимулируя собственное производство) или «выключено» (базовый низкий уровень производства альфа-фактора, недостаточный для активации положительной обратной связи).

Оказалось, что при низкой плотности клеток и слабой положительной обратной связи (низкой концентрации доксициклина) все клетки остаются в состоянии «выключено». Если добавить в среду побольше доксициклина, клетки начинают «включаться». Происходит это исключительно за счет самоактивации (концентрация альфа-фактора в среде остается слишком низкой, чтобы клетка могла активироваться за счет «чужого» феромона).

При высокой плотности популяции и низкой концентрации доксициклина дрожжи, изначально «выключенные», по прошествии нескольких часов вдруг все разом включаются. Но теперь это происходит не из-за самоактивации (для которой положительная обратная связь недостаточно сильна), а из-за того, что в среде накопился альфа-фактор, произведенный совместными усилиями всех клеток. Таким образом, клетки помогают друг другу активироваться. Их поведение при этом становится согласованным: коммуникация с соседями, в отличие от самокоммуникации, обеспечивает синхронную активацию всех клеток сразу.

В природных сигнальных системах, основанных на принципе «secrete and sense», часто присутствуют не только положительные, но и отрицательные обратные связи. Авторам удалось смоделировать и их тоже. Они заставили подопытные штаммы, укомплектованные положительной обратной связью, производить вдобавок протеазу Bar1 — фермент, расщепляющий молекулы альфа-фактора. В итоге получился сигнальный контур с двумя регуляторами: активатором и ингибитором, почти как в морфогенетической модели Тьюринга, которая способна обеспечить самоорганизацию разнообразных сложных структур и узоров.

В этой системе при определенной комбинации параметров (низкой плотности популяции, сильной положительной обратной связи и слабой отрицательной) авторы зафиксировали бимодальное состояние системы: в течение нескольких часов часть клеток находилась в состоянии «включено», часть — в состоянии «выключено». При этом все клетки были генетически идентичны. Различие их поведения определялось, скорее всего, случайной изменчивостью по чувствительности к альфа-фактору (ведь гены определяют количество молекул рецептора на поверхности клетки не строго, а лишь приблизительно) или по активности других компонентов сигнального каскада. Рано или поздно, однако, в этих бимодальных популяциях концентрация альфа-фактора в среде достигала уровня, достаточного для взаимной активации, и тогда все выключенные клетки включались.

Работа показала, что простые сигнальные системы, основанные на принципе «secrete and sense», способны обеспечить разнообразное групповое поведение клеток. Разнообразие порождается своеобразной конкуренцией между самокоммуникацией и коммуникацией с соседями. При низкой плотности популяции на первый план выходит самокоммуникация, потому что вокруг каждой клетки образуется область повышенной концентрации сигнального вещества. Это не позволяет клетке чутко реагировать на сигналы, производимые другими клетками, то есть самокоммуникация блокирует коммуникацию с соседями. При высокой плотности (а также при низкой чувствительности к сигнальному веществу или при низком уровне его производства) коммуникация с соседями становится важнее, чем «разговор с собой». Это делает возможным, например, сложное групповое поведение бактерий, основанное на «чувстве кворума».

Авторы подчеркивают, что в основе такого поведения лежит низкий уровень производства бактериями и самого сигнального вещества, и рецепторов к нему. В результате эффект самокоммуникации слабеет, и клетка настраивается на восприятие сигналов, посылаемых другими клетками. Противоположная картина наблюдается у Т-лимфоцитов: они настроены на самокоммуникацию (производят много интерлейкина-2 и много высокочувствительных рецепторов к нему). Это позволяет в ходе иммунной реакции избирательно размножаться только отдельным клонам Т-клеток, хотя у всех клонов одна и та же система синтеза сигнального вещества и реагирования на него.

Полученные результаты помогут лучше понять и многие загадочные аспекты индивидуального развития многоклеточных, процесса, в котором разнообразные комбинации саморегуляции и взаимной регуляции поведения клеток играют важнейшую роль.

Александр Марков

Источники:

1. elementy.ru