22.07.2014

Условный рефлекс у нематоды формируется на основе инсулинового рецептора

Японские нейробиологи изучили формирование вкусового условного рефлекса (аналог долговременной памяти и обучения) у нематоды C. elegans. Удалось расшифровать стержневой биохимический механизм этого рефлекса, проследив его путь от сформировавшегося поведенческого стереотипа к регуляторным белкам. Биохимическая часть рефлекторного ответа включает общие с млекопитающими (и человеком) элементы — особые сигнальные белки инсулинового рецептора. Ученые полагают, что это делает их исследование перспективной моделью для изучения человеческой памяти и ее соответствующих дефектов.

Почти тридцать лет назад на лекциях на биологических факультетах рассказывали, что у червяков, как и у высших животных, можно выработать условный рефлекс. Тогда этот факт слушателями воспринимался почти как чудо, а верхом творческой мысли виделся Т-образный лабиринт, в котором червяки испытывались на наличие рефлекса. За эти тридцать лет нейробиология (да и вся биология) постепенно, но очень быстро и кардинально обновилась: Эрик Кандель получил за исследование условных рефлексов моллюска аплизии Нобелевскую премию (в 2000 году), ученым удалось залезть в святая святых нейронных передач — синапсы и их хозяйство — и т. д. Теперь изучение условных рефлексов и, соответственно, обучения и памяти у низших беспозвоночных стало нейробиологической рутиной; придумано множество изящных способов формировать и исследовать их условные рефлексы. Мало того, стал подвластен расшифровке механизм образования рефлексов как на уровне нейронных связей, так и на уровне молекулярных каскадов и генов, их кодирующих. Расстояние, пройденное от Т-образного лабиринта до выключаемого ультрафиолетом отдельного белка в конкретном нейроне у изготовленных мутантов, огромно.

Всеми этими новейшими технологиями воспользовались нейробиологи из Токийского университета и программы CREST Японского агентства науки и технологии. Они представили схему работы условного рефлекса: как он срабатывает на клеточном, нейронном, и молекулярном уровне. В их результатах проступают биохимические мотивы формирования долговременной памяти.

Они работали с хорошо известной нематодой C. elegans. У нематод вырабатывали условный рефлекс на присутствие соли. Этот условный рефлекс выступил в качестве одного эпизода памяти. Известно, что нематоды реагируют на определенную концентрацию соли и могут ее запомнить. Известно, что вкусовую рецепцию у нематод обеспечивает нейрон ASER (или его левый аналог ASEL). Также известно, что в процесс запоминания каким-то образом вовлечены белки сигнального каскада инсулинового рецептора PI3K, который участвует в том числе и в процессе запоминания и обучения у высших животных. С этой информации и началось исследование.

Нематод выращивали в среде с определенным количеством соли, но одну группу при этом кормили как следует, а другую держали на голодном пайке. Поэтому у сытой группы та или иная концентрация соли стала ассоциироваться с пищей, а у голодной группы — с голодом. В последующих испытательных тестах нематод сажали в лотки с неоднородной концентрацией соли: она постепенно менялась от одного края лотка к другому от низкой (близкой к нулевой) к высокой. Ученым оставалось только отмечать, в какую сторону отправятся нематоды — к краю с низкой или с высокой концентрацией соли.

Понятно, что все нематоды, согласно выработанному рефлексу, устремлялись к той концентрации соли, которая ассоциировалась у них с пищей. Сытая группа ползла туда, где ощущалась концентрация, знакомая им по благополучной жизни, голодная группа, напротив, именно ее избегала.

Как оказалось, этот рефлекс отсутствует у особей, мутантных по гену daf-2 — это один из участников каскада PI3K. Выяснилось, что в синапсах нейрона ASER, и только там, экспрессируется его особая изоформа. Ее назвали daf-2c: она произведена из другой изоформы daf-2a путем вставки дополнительного экзона. Точно такая же вставка известна и для человеческого инсулинового рецептора IR-B (см. C. Blanquart et al., 2008. Characterization of IRA/IRB hybrid insulin receptors using bioluminescence resonance energy transfer). И у нематод, и у человека эта экзонная вставка экспонируется на поверхности нейронов в синапсах.

Эта аналогия сама по себе захватывающая и сулит немало перспективных открытий в области молекулярных механизмов и эволюции обучения. С человеческими вариантами этих изоформ работы продолжаются, но с результатами данного исследования нематоды их явно обогнали. Удалось выяснить детали процесса запоминания и то, как работают биохимические механизмы в это время.

Эксперименты с мутантами по daf-2c, а также другими участниками сигнального каскада инсулина, показали, что именно эта изоформа, а не daf-2a, участвует во вкусовом обучении. Она экспрессируется только в аксонах ASER, а вторая изоформа — в теле клетки. Для выработки рефлекса важно, чтобы DAF-2c оказался в аксоне рядом с синапсом. Поэтому первоочередную роль получают белки, переправляющие их из тела клетки в аксон. Одним из таких агентов оказался трансмембранный белок CASY-1 из суперсемейства кадгеринов. CASY-1 специфически связывается с новой экзонной вставкой DAF-2c. У мутантов по этому белку (варианту гена) DAF-2c до аксона не добирается, и в результате никакого обучения не происходит. Интересно, что если мутанту вместо DAF-2c насильно (с помощью связующих белков) вставить в аксон DAF-2а, то он сработает так же, как и DAF-2c. Иными словами, для данного вида рецептора важно место; специфическая вставка понадобилась, чтобы это место правильно занять.

У нематод в норме реакция на соль выражается в увеличении количества пузырьков в синапсе нейрона ASER. Применив изощренную технологию, ученые измерили количество пузырьков в синапсах при нормальном проявлении рефлекса, а затем сравнили с мутантными нематодами. У мутантов по daf-2 концентрация пузырьков оказалась сильно повышенной. Зато если включить мутантам daf-2c, то всё возвращается к норме. А включение daf-2а ничего не изменяет: концентрация синаптических везикул остается высокой. Также меняется концентрация везикул и у мутантов по гену casy-1 — она резко возрастает. Это означает, что присутствие DAF-2c увеличивает интенсивность нервной передачи.

CASY-1, в свою очередь, связывается с кинезинами микротрубочек, а они обеспечивают перемещение везикул в синапсы.

Получается, что в аксоне ASER, обслуживающем вкус, и только там, экспрессируется особая форма инсулинового рецептора; она связывается с трансмембранным белком CASY-1, который умеет взаимодействовать с кинезином, и таким образом модулируются нервные импульсы. В этой истории осталось понять, причем тут условный рефлекс и обучение, то есть как регулируется извне продукция ключевого компонента daf-2c.

Удалось обнаружить вещество, которое по мере «воспитания» нематод в голодных условиях снижает свою активность — это важнейший клеточный регулятор ERK. Это вещество соответственно тормозит активность CASY-1 (это тоже пришлось долго и педантично доказывать с помощью использования разнообразных мутантных вариантов). В этом случае DAF-2c доставляется в аксоны в умеренном количестве, везикулы в синаптические щели не выбрасываются, и в результате реализуется рефлекс — избегание солевой концентрации.

С одной стороны, всё проделанное японскими учеными — просто, а с другой — сложно. Просто — потому что мы видим расшифрованную схему формирования рефлекса. Сложно — потому что тут пришлось задействовать не меньше десятка различных технологий тестирования, для каждой — понять, что означает результат теста, перебрать больше сотни вариантов мутаций нематод и у каждого вырабатывать рефлекс. Помимо этого, сложность обусловлена еще и сильным упрощением. Ясно, что на нее накладываются и другие регуляторные механизмы. Например, с тем же самым вкусовым рефлексом работали и раньше и обнаружили специальный белок нематоцин, аналог окситоцина, который также участвует в формировании данного рефлекса. В этой новой работе нематоцин не упоминается, хотя было бы интересно и важно понять, где пересекаются метаболические регуляторные пути нематоцина и DAF-2c.

Источник: Hayao Ohno, Shinya Kato, Yasuki Naito, Hirofumi Kunitomo, Masahiro Tomioka, Yuichi Iino Role of synaptic phosphatidylinositol3-kinase in a behavioral learning response in C. elegans // Science. 2014. V. 345. P. 313–317.

Елена Наймарк

Источники:

1. elementy.ru