29.10.2014

Микроскоп XXI века: молекулы живой клетки в режиме реального времени

Команда Эрика Бетцига создала новый микроскоп, способный снимать живые объекты микромасштаба в режиме реального времени. О его возможностях рассказано на страницах журнала Science. В сухом кратком резюме перечислено, что новый микроскоп (рис. 1) позволяет: регистрировать перемещения одной биомолекулы, увидеть процессы, происходящие внутри клетки, проследить поведение отдельных клеток в окружающем матриксе, а также взаимодействие клеток между собой в многоклеточных системах. В реальности же при взгляде сквозь окуляр нового микроскопа открывается новый захватывающий мир.

Журнал Science на этой неделе пригласил своих читателей в кино: в статье Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution и дополнительных материалах к ней демонстрируются более 20 видеороликов. И это не простые видеоклипы — это микро- или даже наномир, снятый в режиме реального времени. Работа стала результатом труда большого коллектива авторов, среди которых есть и недавний лауреат Нобелевской премии по химии Эрик Бетциг.

На это зрелище действительно стоит посмотреть: перед глазами открывается целый мир движущихся молекул внутри живой клетки. Вот клетка культуры HeLa, а на ее поверхности вытягиваются, дрожат и качаются тонкие нити-филоподии (см. Filopodia). Конечно, превосходные сверхкачественные изображения этих клеток с филоподиями имеются во множестве, но сейчас можно увидеть эти изображения «живыми». Это примерно как мчащийся поезд на широком экране в сравнении с его фотографией.

Кого-то, возможно, больше впечатлит ролик с развивающимся ранним эмбрионом дрозофилы в ходе спинного закрытия. Вроде это тоже известный сюжет, исследованный вдоль и поперек (A. Jacinto et al., 2002. Dynamic Analysis of Dorsal Closure in Drosophila) — но нет: перед нашими глазами клетки с прокрашенными кадгеринами, маркирующими возникающие клеточные контакты, а на следующем ролике — то же самое, но демонстрируется движение клеток с прокрашенными актиновыми нитями: вот они сползаются по направлению друг к другу, клетки меняют форму, сгущаются в одном месте, дрожат, занимая нужную позицию... И это не реконструкция, это — то, что происходит с белками клетки — актином, кадгерином — на самом деле в ходе эмбриогенеза. Можно пометить светящейся меткой другие белки и регуляторы — и опять увидеть в реальном времени картину их экспрессии и работы в клетке, будь это та или иная стадия эмбриогенеза или любой другой биологический процесс. Важно то, что изучаемые объекты продолжают жить на предметном столике.

Куда направляются молекулы белков микротрубочек во время последовательных фаз клеточного деления? — пожалуйста, смотрите другой видеоролик. Вот движутся хромосомы, растут микротрубочки, митохондрии взаимодействуют с эндоплазматическим ретикулумом. Последнее особенно интересно: видно, как эндоплазматический ретикулум преображается в особую «цистерну» (см. L. Lu, M. S. Ladinsky, T. Kirchausen, 2009. Cisternal Organization of the Endoplasmic Reticulum during Mitosis), вмещающую митохондрии, и можно отследить специфические перемещения и тех, и других. Никакие графики и никакая фотография не передает живой динамики клеточного деления (рис. 2).

Некоторые из представленных видео не только поучительны, но и весьма забавны: хорошо видны суетливые движения инфузории Tetrahymena thermophila или видно, как прокладывает свой извилистый путь клетка пронейтрофила (HL-60), буквально продираясь сквозь волокна коллагена (рис. 3). В первом случае удается точно оценить число биений жгутиков, что важно для сопоставления скоростей биохимических и фенетических проявлений. Второй пример еще более актуален: это модель нейтрофила, который направляется сквозь трехмерную ткань, укрепленную коллагеном, к зараженному участку.

Достойно описать словами эти ролики невозможно. Можно лишь привести краткий перечень новых наблюдений, открытий, которые позволяет сделать новая техника. Но это будет скорее напоминать рекламу нового микроскопа, которая уже существует в достаточно культурном и красивом виде (правда, по-английски). В этом тексте приводятся слова Э. Бетцига, который оправдывает быструю коммерциализацию новой техники:

Чтобы адаптировать рабочий высокотехнологичный прототип к современным возможностям изображения, потребовались колоссальные усилия. В конечном итоге, коммерциализация — это необходимый завершающий шаг, призванный убедить научное общество, что новый продукт открывает широкие исследовательские перспективы.

(It takes a huge amount of effort to move from a successful high-tech prototype to broader adoption of an imaging technology. Ultimately, commercialization is the crucial last step to ensuring that these technologies can have broad impact in the research community.)

Действительно, понятно, что новый микроскоп и вправду исключительно перспективен, но его рекламой пусть занимается компания Carl Zeiss, которой теперь принадлежат права на эту технику. Здесь имеет смысл лишь отметить, чем этот микроскоп отличается от всех других.

При микроскопировании живых объектов возникают две основных проблемы. Во-первых, чтобы получать изображения с высоким разрешением, нужно объект осветить; но чем выше интенсивность освещения, тем быстрее объект умирает. Во-вторых, чтобы получить изображения объекта, меняющего свою позицию в пространстве, нужны вычисления, которые занимают время; значит, чем быстрее движется объект, тем меньше вероятность получить его изображение в хорошем разрешении. Эти проблемы взаимосвязаны, так как хорошее разрешение требует большего освещения и, значит, предполагает более короткий промежуток жизни изучаемого объекта под микроскопом. Обе эти проблемы удалось обойти, применив для освещения световую плоскость, созданную лучами Бесселя (рис. 4).

Освещение световой плоскостью используется во флуоресцентных микроскопах, но вот лучи Бесселя были предложены для микроскопирования только в 2011 году все той же командой Эрика Бетцига (см. статью T. A. Planchon et al., 2011. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination). За прошедшее время эта аппаратура была усовершенствована за счет особого метода разделения световой плоскости оптической решеткой на отдельные параллельные лучи. Каждый луч имеет меньшую интенсивность и, соответственно, производит на клетку меньший повреждающий эффект. Придумана также система, позволяющая быстро продуцировать образ объекта. Тут задействованы соотношения между длинами волны, индуцированной скоростью вибрации лучей и сглаживанием результирующих изображений. (Для более точной информации об этой технологии лучше обратиться к дополнительным материалам к статье.)

Источник: Bi-Chang Chen et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution // Science. 2014. V. 346. P. 439. DOI: 10.1126/science.1257998.

Елена Наймарк

Источники:

1. elementy.ru