10.09.2015

Родственные интернейроны у эмбрионов мышей расселяются по переднему мозгу независимо друг от друга

В ходе эмбрионального развития новообразованные нейроны в головном мозге расселяются по разным его участкам. Чтобы узнать, как развитие мозга у зародыша влияет на работу этого органа в будущем, надо понять, есть ли в этом расселении какая-то закономерность. Говорить про все нейроны сразу очень сложно, а вот про ГАМК-интернейроны недавно выяснилось, что их конечное расположение в коре больших полушарий не зависит от местонахождения их ближайших родственников. Это значит, что для расселения нейронов по головному мозгу важнее влияние окружающих клеток, чем их происхождение.

Если мы хотим понять, как формируются интеллект, память и сознание, мы должны знать, как складываются судьбы их «носителей» - нейронов и по каким законам эти клетки работают. В идеале, хорошо бы отследить эмбриональное происхождение и связи каждого нейрона в нервной системе, но пока это возможно сделать только для одного существа - круглого червя Caenorhabditis elegans, у которого в нервной системе всего-то 302 клетки. Для более сложных существ приходится группировать нейроны мозга по различным признакам и находить какие-то закономерности развития и функционирования, характерные для группы в целом.

Одна из таких групп - ГАМК-эргические (то есть выделяющие в качестве нейромедиатора гамма-аминомасляную кислоту, ГАМК) интернейроны (промежуточное звено в цепочке передачи нервного импульса) переднего мозга. К переднему мозгу относится кора больших полушарий, гиппокамп, базальные ганглии, таламус, гипоталамус (все эти структуры парные), а также гипофиз и эпифиз.

ГАМК - тормозный медиатор, то есть его действие останавливает передачу сигнала от клетки к клетке. Это нужно, чтобы предотвратить возбуждение нейронов, которое возникло не вовремя или оказалось слишком сильным. На ГАМК-эргических интернейронах лежит, по сути, руководство всеми электрическими импульсами переднего мозга. Эти клетки «решают», какой сигнал пройдет, какой нет, какой он будет силы. За счет разветвленной сети отростков они в некоторой степени даже определяют, куда этот сигнал поступит. Если по каким-то причинам торможение, обусловленное ГАМК, нарушено, это может проявиться в мышечных судорогах (эпилепсия), повышенном тонусе мышц (церебральный паралич) или неконтролируемых движениях (хорея Гентингтона, синдром Туретта).

У млекопитающих ГАМК-интернейроны в процессе эмбрионального развития появляются из медиальных ганглиозных бугорков (MGE), расположенных вплотную к желудочкам мозга (рис. 1) (это парное образование, но для простоты дальше оно будет упоминаться в единственном числе). Эта структура есть только у зародышей, у взрослых животных ее не выделяют. В медиальном ганглиозном бугорке находятся предшественники ГАМК-нейронов. Они делятся, и получившиеся клетки мигрируют в будущую кору больших полушарий - и не только в нее, но и в другие области переднего мозга. Куда еще они расселяются, в каком порядке и в каких количествах, как раз и предстояло выяснить (рис. 2). Почему эта информация важна? Если окажется, что нейроны-потомки одной клетки-предшественницы мигрируют в мозге в одну и ту же область, то, вероятно, они будут обрабатывать одни и те же сигналы. То есть по месту образования ГАМК-интернейрона в медильном ганглиозном бугорке зародыша можно будет предугадать функцию этого нейрона у взрослого организма. Если такой закономерности нет, предсказывать судьбу ГАМК-интернейронов в зрелом мозге будет значительно сложнее.

Два предыдущих исследования (K. Brown et al., 2011. Clonal Production and Organization of Inhibitory Interneurons in the Neocortex и G. Ciceri et al., 2013. Lineage-specific laminar organization of cortical GABAergic interneurons) показали, что тормозные интернейроны распространяются в определенном порядке: клетки-клоны оказываются либо друг над другом в соседних слоях коры больших полушарий, либо в одном слое, но в пределах функциональной колонки коры - небольшой группы клеток, занимающихся общей небольшой задачей.

Однако группа ученых из США и Австрии решила перепроверить эти результаты, посчитав эксперименты своих коллег недостаточно точными. Дело в том, что авторы двух предыдущих работ, чтобы отследить перемещения новообразованных нейронов, метили их ретровирусами, несущими ген зеленого флуоресцентного белка. Такой подход предполагает, что клетки с одинаковой флуоресцентной меткой, расположенные далеко друг от друга, произошли от разных предшественников. Однако это всего лишь допущение, а не аксиома.

Чтобы точно узнать, «видятся» ли друг с другом клональные братья и сестры, ученые применили метод ДНК-штрихкодирования (DNA barcoding). Но если ДНК-штрихкоды, которые которые используются для систематики видов (см. ДНК-штрихкодирование - штангенциркуль биологической систематики), изначально присутствуют в клетках организма, то ДНК-штрихкоды для отслеживания ГАМК-интернейронов исследователи привносили извне, вводя путем микроинъекций в желудочки мозга зародышей мышей модифицированный вирус саркомы и лейкемии птиц подтипа А (рис. 3). Вирус содержал в себе «штрихкоды» - небольшие кусочки ДНК, по которым впоследствии можно было распознать конкретный нейрон. Помимо этого, каждый вирус нес в себе ген GFP, чтобы по экспрессии этого белка ученым позже удалось увидеть и выделить нужную клетку. Каждому зародышу вводили вирусы с самыми разнообразными штрихкодами. Это разнообразие было настолько велико, что практически каждый предшественник интернейронов получал уникальную метку. Таким образом, все его потомки имели одинаковые ДНК-штрихкоды.

Процедуру проводили на десятый с половиной - двенадцатый с половиной день эмбрионального развития, так как именно в это время процесс образования ГАМК-интернейронов идет особенно интенсивно. На шестнадцатый день после рождения, когда миграция интернейронов завершается, мышатами приходилось жертвовать. Из их мозга делали серии срезов, а из каждого среза путем лазерной захватывающей микродиссекции вырезали только те группы клеток, в которых присутствовал зеленый флуоресцентный белок. Наличие GFP проверяли с помощью флуоресцентной микроскопии.

Таким образом, расположение ГАМК-интернейронов проверяли в два этапа. На первом этапе флуоресценция GFP позволяла выявить, в каких участках мозга оказываются клетки, происходящие из медиального ганглиозного бугорка (рис. 4).

На втором этапе, после вырезания этих клеток, из каждой выделяли фрагменты ее ДНК, содержащие в том числе ее штрихкод (рис. 5). C помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) число таких фрагментов многократно увеличивали, а потом вводили их в составе плазмид в бактерии. Размножаясь, бактерии снова повышали число копий этих фрагментов ДНК, после чего биологи уже могли с ними работать и оценивать число нейронов, в которых содержался тот или иной штрихкод.

Результаты получились неожиданные. Во-первых, ГАМК-интернейроны, образующиеся в медиальном ганглиозном бугорке, в своем расселении в пределах одного полушария не ограничены, по сути, ничем. Большинство из них (41-81%) оказывались в коре больших полушарий, но в то же время немалый их процент находили и в подкорковых структурах - гиппокампе (1-13%) и стриатуме (3-9%). Некоторое количество меченых ГАМК-интернейронов «осели» в обонятельной луковице, амигдале и гипоталамусе. Во-вторых, клетки-клоны далеко не всегда оказывались друг рядом с другом. В клеточном масштабе «рядом» - это в пределах 400 микрон, а судя по результатам исследования, близкородственные ГАМК-интернейроны были расположены в среднем на расстоянии 1400-1800 микрон (1,4-1,8 мм) друг от друга. Более того, клоны часто попадали в совершенно разные структуры мозга. Например, клетки одного клона можно было обнаружить в коре, гиппокампе и стриатуме.

Так по какому же правилу тогда распространяются новообразованные ГАМК-интернейроны? Пока сложно сказать. Возможно, главный фактор, влияющий на путь их расселения, - их окружение. Тормозный интернейрон, попадая, скажем, в гиппокамп, получает сигналы от соседних клеток и включается в совершенно иную цепочку передачи нервных импульсов, нежели его «брат», оказавшийся в коре того же полушария. Это показывает, что не только работа зрелого мозга, но и его формирование весьма пластично и во многом зависит не от генотипа, а от условий окружения.

Источник: Christian Mayer, Xavier H. Jaglin, Lucy V. Cobbs, Rachel C. Bandler, Carmen Streicher, Constance L. Cepko, Simon Hippenmeyer, Gord Fishell. Clonally Related Forebrain Interneurons Disperse Broadly across Both Functional Areas and Structural Boundaries // Neuron. September 2015. V. 87. Issue 5. P. 989-998.

Светлана Ястребова

Источники:

1. elementy.ru