24.11.2016

Метаморфоз у личинок червя Hydroides elegans запускается бактериями

Развитие трубчатых многощетинковых червей проходит с метаморфозом, при котором свободноплавающая личинка превращается в сидячую взрослую особь. Обязательным условием протекания метаморфоза у этих животных является контакт с бактериями Pseudoalteromonas luteoviolacea, которые образуют биопленки на поверхностях подводных объектов. Исследователи из Америки и Швейцарии изучили молекулярные механизмы, обеспечивающие специфическое взаимодействие между червем и бактериями и опосредованную этим взаимодействием регуляцию метаморфоза. Оказалось, что в передаче сигнала задействованы гены бактерий, полученные ими в прошлом от бактериофагов. Контакт бактерий с личинкой червя запускает у нее сигнальные каскады MAPK, активирующие киназы p38 и Jnk, которые, в свою очередь, включают транскрипцию группы генов, участвующих в онтогенетических превращениях личиночных тканей и органов в процессе метаморфоза.

Гидроиды (Hydroides) — это один из родов трубчатых червей (семейство Серпулиды), класса многощетинковых червей. Их характерная особенность — сидячий образ жизни и формирование известковых трубок, в которых они прячутся от хищников. На голове эти черви несут красивые венчики жаберных лопастей, которые служат им одновременно и органами дыхания, и приспособлениями для улавливания частичек пищи. Один из их представителей — Hydroides elegans, широко распространенный вид в морях и океанах тропических и субтропических широт. Эти черви формируют массивные колонии на различных подводных объектах, в том числе на днищах морских судов, что представляет серьезную экономическую проблему. Вместе с тем они входят в число удобных модельных организмов для биологических исследований.

В своем развитии гидроиды проходят через стадию свободноплавающей личинки, которая должна найти подходящее место для прикрепления и дальнейшего превращения во взрослую сидячую особь. Выбор места важен, поскольку от него зависит, во-первых, обилие пищи и, во-вторых, наличие поблизости потенциального полового партнера для произведения потомства. Оказалось, что метаморфоз личинок у H. elegans инициируется бактериями Pseudoalteromonas luteoviolacea, формирующими биопленки на поверхностях подводных камней (а также подводных частей морских судов). Этот факт был обнаружен еще в 1999 году (см. C. R. C. Unabia, M. G. Hadfield, 1999. Role of bacteria in larval settlement and metamorphosis of the polychaete Hydroides elegans).

Обычно переходы между последовательными стадиями онтогенеза происходят под контролем внутренних регуляторных факторов, в частности гормонов и нейротрансмиттеров. Однако в рассматриваемом случае прохождение метаморфоза требует обязательного получения внешнего сигнала, производимого бактериями. Нужно отметить, что зависимость протекания ранних стадий онтогенеза от стимулов, производимых теми или иными бактериями или другими одноклеточными, была установлена для целого ряда животных — как первичноротых, так и вторичноротых, включая стрекающих (медуз, кораллов), морских губок, крабов, двустворчатых моллюсков, асцидий и морских ежей. При этом успешность индукции метаморфоза животного зависит не только от видового состава, но и от физиологического состояния контактирующих микроорганизмов. Все известные случаи такого рода касаются животных, у которых имеется чередование подвижных личиночных и малоподвижных взрослых стадий жизненного цикла. Молекулярные механизмы осуществляемой регуляции в большинстве случаев пока остаются неизученными.

Коллектив авторов обсуждаемой работы в последние несколько лет проводил исследования, нацеленные на расшифровку молекулярных механизмов, обеспечивающих контроль метаморфоза червя H. elegans бактериями P. luteoviolacea. Результаты исследований были представлены ими в двух статьях, первая из которых вышла в журнале Science в 2014 году, а вторая — в сентябре 2016 года в журнале PNAS.

Полный жизненный цикл H. elegans показан на рис. 2, а на рис. 3 показаны последовательные стадии превращения свободноплавающей личинки в ювенильную особь. Этот процесс, занимающий несколько часов, в ускоренном виде можно посмотреть на видео из дополнительных материалов к обсуждаемой статье в PNAS.

Сначала нужно было выяснить, какие бактериальные гены необходимы для индукции метаморфоза червя. Для этого использовались штаммы бактерий с различными делециями. После экспериментального выявления делеций, нарушающих нормальное протекание метаморфоза, оставалось выяснить, какие гены располагаются в области данных делеций. Такой подход позволил обнаружить два кластера генов, необходимых для индукции метаморфоза червя.

Первая группа генов, названных авторами исследования MAC (metamorphosis-associated contractile structures), включает 4 открытых рамки считывания, кодирующих белки, гомологичные белкам хвостов сократимых фагов. В частности, ген macS кодирует белок сократимого чехла, гены macT1 и macT2 — белки внутреннего полого стержня, ген macB — белок базальной пластинки. Оказалось, что эти белки экспрессируются у нескольких процентов бактериальных клеток, формируя на их поверхности крупные комплексы с упорядоченной структурой, состоящие из сотен стержней, организованных наподобие фаговых хвостов. Электронная микрофотография и виртуальная модель этого комплекса показаны на рис. 4. Отсутствие (делеция) какого-либо гена из набора MAC приводит к отсутствию этих комплексов и к неспособности бактерий инициировать метаморфоз у H. elegans (рис. 4, В, Г).

Вторая область размером около 8 тысяч пар нуклеотидов, обозначенная авторами JF50_12590–JF50_12615, включает 6 белок-кодирующих генов. Их функции неизвестны, и гомологи у каких-либо других организмов не обнаружены. Эта группа генов находится на расстоянии около 12 тыс. пар оснований от группы MAC-генов. Бактерии, у которых этот участок делетирован, при наличии полного набора MAC-генов индуцировали прохождение первых двух этапов метаморфоза (включая утрату ресничек), но дальнейшие стадии метаморфоза отсутствовали (рис. 4, Г). Вместе с тем, отсутствие этой группы генов не препятствует формированию бактериями комплексов фагоподобных структур. Следовательно, они причастны к индукции метаморфоза каким-то иным образом. Возможно, продукты этих генов работают как усилители в обеспечении взаимодействия между клетками червя и комплексами из MAC-белков или являются шаперонами для этих белков. Проверкой этих гипотез авторы обещают заняться в дальнейших исследованиях. Таким образом, полноценный метаморфоз требует присутствия полного набора всех генов обоих вышеобозначенных локусов. На еще одном видео из дополнительных материалов к обсуждаемой статье в PNAS можно увидеть прохождение метаморфоза личинок при добавлении бактерий дикого типа и отсутствие метаморфоза при добавлении бактерий, имеющих делеции некоторых необходимых генов.

И наконец, авторы изучили те изменения на уровне активности генов у червя, которые инициируются взаимодействием с бактериями и необходимы для протекания всех стадий метаморфоза. Транскрипцию генов в теле личинки определяли через 5 и через 30 минут после взаимодействия личинки с белками MAC и сравнивали полученные данные с образцами личинок, не взаимодействовавших с белками MAC. Через 30 минут после инициации метаморфоза (реснички у личинок к этому моменту уже были утрачены) в теле личинок оказалась повышена экспрессия нескольких десятков генов, среди которых гены белков, отвечающих за передачу сигналов; белков межклеточной адгезии; металлопротеиназ — белков, которые у всех животных обеспечивают перестройку тканей во время морфогенеза; белков, участвующих в обеспечении врожденного иммунитета, а также нескольких транскрипционных факторов, среди которых и классические мишени сигнальных каскадов MAPK (эти каскады образуются серией белков, активирующих друг друга путем присоединения фосфатных групп).

Авторы далее проверили, не связан ли оказываемый бактериями эффект как раз индукцией сигнальных каскадов MAPK. Для проверки этой гипотезы были проведены эксперименты с использованием специфичных ингибиторов некоторых киназ этих каскадов, а именно киназы ERK1/2 (ингибитор U0126), p38 (ингибитор SB203580) и Jnk (ингибитор SP600125). Результаты экспериментов, показанные на рис. 5, позволили установить, что метаморфоз, инициируемый взаимодействием червя с бактериальными факторами, опосредован активацией киназ p38 и Jnk. Эти киназы активируют транскрипционные факторы, которые далее обеспечивают активацию транскрипции генов, необходимых для прохождения всех стадий метаморфоза у червя.

Исследование явно ждет своего продолжения. Авторы так и не выяснили пока, каким образом обеспечивается активация метаморфоза белками MAC — имеет ли место простое взаимодействие с какими-то мембранными рецепторами клеток червя или эти фагоподобные структуры работают именно как шприцы (как это делают фаги), вводя какие-то индукторные молекулы в цитоплазму клеток личинки червя. Не выяснена функция еще 6 необходимых бактериальных белков. Также интересна эволюционная предыстория сложившихся взаимоотношений между бактериями и трубчатым червем. В чем заключается выгода каждого вида от такого союза? Насколько универсальны подобные схемы межвидового взаимодействия и их механизмы?

Источники:

1) N. J. Shikuma et al. Marine Tubeworm Metamorphosis Induced by Arrays of Bacterial Phage Tail–Like Structures // Science. 2014. DOI: 10.1126/science.1246794.

2) N. J. Shikuma et al. Stepwise metamorphosis of the tubeworm Hydroides elegans is mediated by a bacterial inducer and MAPK signaling // PNAS. 2016. DOI: 10.1073/pnas.1603142113.

Татьяна Романовская

Источники:

1. elementy.ru