18.09.2017

«Альтернативная история» белков проливает свет на роль случайности в эволюции

Американские биологи изучили альтернативные пути, которыми могла пойти эволюция стероидных рецепторов позвоночных — семейства белков с хорошо известной эволюционной историей. Ее ключевым событием была дупликация исходного белка, распознающего нуклеотидную последовательность AGGTCA, после чего одна копия сохранила прежнюю функцию, а другая, приобретя 14 мутаций (11 «разрешающих» и три ключевые мутации в ДНК-связывающем участке), стала связываться с последовательностью AGAACA. Синтезировав сотни тысяч альтернативных белков и экспериментально проверив их функциональность, исследователи показали, что эволюция могла прийти к тому же результату сотнями разных путей, многие из которых были ничем не хуже реализованного. По-видимому, выбранный эволюцией путь определялся в основном случайностью. Результаты подобных случайностей могут быть «заморожены» позднейшими мутациями, которые делают недосягаемыми доступные ранее эволюционные маршруты.

Расхожая мудрость гласит, что история не знает слова «если», и если это так, то мне жаль историю как науку. К счастью, в эволюционной биологии сослагательное наклонение не только допускается, но в последнее время всё чаще становится основой для интереснейших исследовательских программ. «Альтернативную историю» живых организмов можно изучать как в эволюционных экспериментах с большим числом повторностей, так и путем искусственного синтеза множества альтернативных вариантов генов и белков (в том числе реконструированных предковых, давно исчезнувших вариантов) и их последующего экспериментального изучения. Нынешний уровень развития методов молекулярной биологии уже позволяет в рамках одного исследования прощупать обширные области «ландшафта приспособленности».

Джозеф Торнтон (Joseph W. Thornton), ныне работающий в Чикагском университете, — известный специалист по «воскрешению» древних белков и изучению механизмов приобретения белками новых функций.

Ранее Торнтон детально изучил эволюцию стероидных рецепторов (см. Steroid hormone receptor) позвоночных животных (рис. 1). Стероидные рецепторы связываются с различными стероидными гормонами, а затем присоединяются к определенным регуляторным последовательностям ДНК и запускают экспрессию генов, рядом с которыми эти последовательности находятся.

Торнтон реконструировал (на основе анализа эволюционного дерева) и «воскресил» предковый стероидный рецептор (AncSR1), которым обладали базальные позвоночные в начале фанерозоя. Оказалось, что AncSR1 связывался с регуляторной последовательностью AGGTCA. Точнее, две молекулы белка, образующие димер, связывались с двумя такими последовательностями, развернутыми в разные стороны и образующими так называемый палиндром: AGGTCA - - - TGACCT (генетические палиндромы читаются в обратную сторону по комплементарной цепи ДНК, так что приведенная последовательность действительно читается в обе стороны одинаково). Эта последовательность сокращенно называется ERE (oestrogen response element).

В дальнейшем белок AncSR1 дуплицировался. Одна из его копий сохранила исходное строение ДНК-связывающего участка (recognition helix, RH) с ключевыми аминокислотами EGKA (глутаминовая кислота, глицин, лизин, аланин), которые обеспечивают прикрепление белка к ERE. Этот белок дал начало эстрогеновым рецепторам современных позвоночных.

Вторая копия сменила специфичность и стала связываться с палиндромом AGAACA - - - TGTTCT (SRE, steroid response element). Этот новый белок, AncSR2, дал начало андрогеновым, прогестагеновым и кортикостероидным рецепторам. Смена специфичности произошла благодаря трем аминокислотным заменам в RH, превратившим последовательность EGKA в GSKV (глицин, серин, лизин, валин). Впрочем, сами по себе эти три аминокислотные замены хоть и меняют специфичность белка, однако делают связь с ДНК слишком слабой, чтобы запустить экспрессию генов. Иными словами, если взять белок AncSR1 и заменить в нем EGKA на GSKV, ничего больше не меняя, то получившийся белок будет лучше связываться с SRE, чем с ERE, но всё же он будет делать это недостаточно хорошо, чтобы включать гены, контролируемые регуляторным элементом SRE.

Торнтон показал, что необходимым предварительным условием для закрепления трех ключевых замен (то есть для того, чтобы они оказались полезными и были поддержаны отбором) было приобретение 11 других аминокислотных замен в других частях белковой молекулы (за пределами RH). Торнтон назвал эти мутации «разрешающими» (permissive). Он предположил, что они повысили аффинность белка в равной степени к обоим регуляторным элементам, ERE и SRE, что и позволило белку сменить функцию. В отсутствие этих одиннадцати мутаций отбор не смог бы поддержать три ключевые мутации в RH, потому что это привело бы к утрате функциональности.

Таким образом, путь от исходной функции (распознавание ERE) к новой (распознавание SRE) был пройден в два этапа: сначала были приобретены 11 «разрешающих» мутаций (11P), а затем три аминокилостные замены в RH, превратившие EGKA в GSKV.

В новой работе, опубликованной в журнале Nature, Торнтон и его коллеги задались целью выяснить, был ли этот эволюционный маршрут единственно возможным или у эволюции были и другие способы прийти из точки А в точку Б (то есть сделать из белка, распознающего ERE, но не SRE, белок, распознающий SRE, но не ERE).

В качестве стартовой точки авторы взяли белок AncSR1+11P, то есть предковый стероидный рецептор с одиннадцатью «разрешающими» мутациями. Они синтезировали гены таких белков со всеми возможными комбинациями четырех аминокислот, занимающих ключевые позиции в RH. Всего, таким образом, получилось 204 = 160 000 разных белков. Их гены вставили в дрожжевые клетки, в которые был также добавлен ген зеленого флуоресцирующего белка, управляемый либо элементом ERE, либо SRE. Таким образом, если вариант стероидного рецептора, доставшийся данной дрожжевой клетке, способен включать экспрессию генов, управляемых ERE или SRE, это сразу видно по флуоресценции.

Светящиеся клетки отбирали при помощи флуоресцентного сортинга (Fluorescence-activated cell sorting) и определяли последовательность гена стероидного рецептора. Таким образом удалось классифицировать все 160 000 вариантов, каждый из которых был отнесен к одной из четырех категорий: ERE-специфичные, SRE-специфичные, неразборчивые (связывающиеся с обоими регуляторными элементами), нефункциональные.

Оказалось, что кроме последовательности GSKV, которая была «найдена» реальной эволюцией, в пространстве всех возможных последовательностей RH существует еще 828 комбинаций аминокислот, обеспечивающих не менее качественное (то есть как минимум такое же сильное и такое же избирательное) связывание регуляторного элемента SRE. Обнаружились также 144 ERE-специфичные комбинации (реальная, «историческая» последовательность EGKA — лишь одна из них) и 378 «неразборчивых», связывающихся и с ERE, и с SRE. Остальные 158 649 последовательностей оказались нефункциональными.

Проанализировав структуру найденных функциональных последовательностей, авторы обнаружили, что интересующие их свойства стероидного рецептора (способность прочно прикрепляться к нуклеотидам AGGTCA, но не к AGAACA, или наоборот) могут быть реализованы множеством разных способов. При этом разные аминокислотные остатки, расположенные в RH, по-разному взаимодействуют с разными нуклеотидами.

Таким образом, найденные эволюцией варианты как стартовой, так и конечной точки эволюционного маршрута вовсе не являлись единственно возможными.

Впрочем, это еще не значит, что эволюция могла пойти как угодно, а выбранный ею путь — не более чем историческая случайность. Чтобы понять, сколько у эволюции было реально доступных маршрутов, нужно исследовать структуру ландшафта приспособленности и определить степень его «проходимости».

Авторы представили пространство функциональных последовательностей в виде карты, на которой точками отмечены все функциональные варианты RH, а линиями — переходы между ними, которые можно совершить при помощи одной-единственной несинонимичной нуклеотидной замены. Авторы исходили из логичного предположения о том, что у эволюционирующего белка мало шансов преодолеть «пропасть» на ландшафте приспособленности. Иными словами, маршрут, проходящий хотя бы через один нефункциональный вариант, считался запрещенным и не отображался на карте (поскольку мутации, делающие белок нефункциональным, не будут поддерживаться отбором, а одновременное появление сразу двух мутаций, позволяющих «перепрыгнуть» через промежуточный нефункциональный вариант, маловероятно).

Получившаяся карта разрешенных эволюционных маршрутов в пространстве последовательностей RH показана на рис. 2. Оказалось, что ландшафт приспособленности в данном случае легко проходим. Хотя большинство возможных вариантов нефункциональны (и не показаны на рисунке), практически все функциональные варианты образуют единую сеть, по которой эволюционирующий белок может свободно перемещаться.

Реальный эволюционный маршрут от EGKA к GSKV был пройден в три шага (три несинонимичные замены). При этом из той же самой начальной точки (EGKA) за такое же или меньшее количество шагов можно было прийти к 64 другим последовательностям, которые обеспечили бы столь же надежное и избирательное связывание SRE, как и «историческая» последовательность GSKV (эти 64 последовательности показаны желтыми точками на рис. 2). Даже если ввести дополнительные ограничения — например, запретить слишком сильное и слишком слабое взаимодействие с ERE и SRE, оставив разрешенным только узкий диапазон силы связывания, или добавить обязательное требование, что сила связывания с SRE должна расти на каждом шаге (такое требование соответствует эволюции под действием отбора на силу связывания с SRE), — всё равно «исторический» эволюционный маршрут не будет ни единственным, ни кратчайшим, ни самым вероятным. Похоже, этот маршрут действительно был выбран эволюцией более или менее случайно.

Анализ карты также показал, что результат эволюции — появление SRE-специфичного белка — довольно слабо зависит от выбора стартовой точки, то есть от исходной ERE-специфичной последовательности. Из 144 обнаруженных авторами ERE-специфичных последовательностей только две не связаны проходимыми маршрутами со всеми остальными. Более того, от 90% ERE-специфичных последовательностей можно дойти до какой-нибудь SRE-специфичной последовательности всего за 1, 2 или 3 мутационных шага, то есть путем не более длинным, чем тот, что был проделан реальной эволюцией. Иными словами, если бы исходный стероидный рецептор позвоночных, связывающийся с ERE, имел другую структуру ДНК-связывающего участка (почти любую другую структуру), это нисколько не помешало бы ему со временем дать начало SRE-специфичному рецептору.

Правда, если бы начальная точка оказалась другой, то и конечная, скорее всего, отличалась бы от исторической последовательности GSKV. Дело в том, что от разных ERE-специфичных последовательностей короткие (не более трех шагов) маршруты ведут к разным наборам SRE-специфичных последовательностей. Впрочем, эти молекулярные подробности, скорее всего, вообще никак не повлияли бы на самих позвоночных, на их жизнь и на эволюцию системы гормональной регуляции.

Авторы также попытались разобраться в той роли, которую сыграли в эволюции стероидных рецепторов 11 «разрешающих» мутаций (11P). Как мы помним, без них ДНК-связывающий участок GSKV взаимодействует с SRE слишком слабо, чтобы запускать экспрессию генов, контролируемых SRE. Ранее Торнтон и его коллеги предположили, что разрешающие мутации повысили сродство рецептора к обоим регуляторным элементам (ERE и SRE), что повысило эволюционный потенциал белка и вероятность приобретения им новой функции. Новое исследование подтвердило это предположение.

В описанном выше эксперименте случайные мутации ДНК-связывающего участка вносились в белок AncSR1+11P. Таким образом, изучался эволюционный потенциал предкового стероидного рецептора позвоночных, уже имеющего 11P. Авторы не поленились проделать всё то же самое (а именно синтезировать 160 000 вариантов белка и оценить их взаимодействие с регуляторными элементами ERE и SRE) на базе предкового белка AncSR1 без разрешающих мутаций. Таким образом, на этот раз изучался эволюционный потенциал исходного стероидного рецептора до того, как он приобрел 11P.

Картинка получилась принципиально иная (рис. 3). В отсутствие 11P число функциональных вариантов оказалось на порядок меньше: всего 43 ERE-специфичных, 45 неразборчивых и 41 SRE-специфичных последовательностей. Кроме того, снизилась проходимость ландшафта приспособленности: далеко не все точки на рис. 3 связаны в единую сеть, а маршруты от ERE-специфичных вариантов к SRE-специфичным в большинстве случаев длиннее, чем на рис. 2. Например, от «исторического» начального варианта EGKA до ближайшего SRE-специфичного варианта можно добраться лишь за пять шагов. Кроме того, все маршруты обязательно проходят через «неразборчивые» промежуточные этапы (на рис. 2 это не так).

Меньшее число доступных эволюционных маршрутов и их большая длина соответствуют пониженной вероятности эволюции SRE-специфичного белка из ERE-специфичного в отсутствие 11P. Авторы также подчеркивают, что дополнительные промежуточные шаги, появляющиеся на пути от ERE-специфичных последовательностей к SRE-специфичным в отсутствие 11P, демонстрируют необходимость других «разрешающих» мутаций (в данном случае эту роль играют мутации, расположенные прямо в ДНК-связывающем участке белка).

Но всё же приходится признать, что даже без 11 разрешающих мутаций эволюция хоть и с трудом, но могла бы из ERE-специфичного белка (в том числе из белка с ДНК-связывающим участком EGKA) сделать SRE-специфичный белок, двигаясь единичными мутационными шагами и минуя «запретные области» ландшафта приспособленности (нефункциональные варианты). Исторический вариант GSKV не функционален (а значит, и не достижим) в отсутствие 11P, но некоторые другие SRE-специфичные варианты все-таки остаются доступными.

Таким образом, исследование показало, что эволюция могла создать SRE-специфичный белок из ERE-специфичного множеством способов, и тот «выбор», который она сделала, был в значительной мере случайным. Сам по себе отбор на новую функцию не мог провести белок по какому-то одному строго определенному эволюционному маршруту. Выбор пути зависел, во-первых, от набора «разрешающих» мутаций, закрепление которых было случайным в том смысле, что не зависело от потребности в новой функции. Во-вторых, выбор одного из маршрутов, доступных при данном наборе разрешающих мутаций, тоже был, судя по всему, случайным.

Несмотря на большое разнообразие эволюционно доступных SRE-специфичных последовательностей, тот вариант, который реально возник в ходе эволюции (GSKV), оказался весьма консервативным, то есть уже не менялся в ходе дальнейшей эволюции. Чтобы это объяснить, необходимы дополнительные исследования; пока же приходится довольствоваться гипотезами. В принципе, это может быть связано с тем, что последовательность GSKV обладает каким-то неизвестным нам преимуществом. Полученные результаты говорят о том, что если такое преимущество и существует, то оно не связано с основной функцией ДНК-связывающего участка — способностью избирательно прикрепляться к регуляторному элементу SRE. Многие другие последовательности делают это ничуть не хуже. Другое возможное объяснение состоит в том, что последовательность GSKV была «законсервирована» последующими эволюционными изменениями. Например, какие-то полезные мутации, закрепившиеся под действием отбора вскоре после появления белка AncSR2 с последовательностью GSKV, возможно, были полезными только в таком контексте, то есть в сочетании с GSKV. Ранее Торнтон и его коллеги показали на примере кортикостероидных рецепторов, как последующие мутации с небольшими эффектами могут «замораживать» результаты предшествующей эволюции, делая ее необратимой.

Подготовлено по материалам: Tyler N. Starr, Lora K. Picton & Joseph W. Thornton. Alternative evolutionary histories in the sequence space of an ancient protein // Nature. Published online 13 September 2017. DOI: 10.1038/nature23902.

Александр Марков

Источники:

1. elementy.ru