Опыт 2.3. Сравнение численности бактерий в свежем и несвежем молоке

Если одиночную клетку бактерии поместить на питательный агар, она образует целую колонию, которая в отличие от исходной клетки видна невооруженным глазом. Этим можно воспользоваться для подсчета бактерий.

Простерилизуйте оборудование. Первая часть опыта основана на использовании метода серийных разведений. Число бактерий в молоке огромно, поэтому для подсчета удобнее брать пробу небольшого объема и разводить ее в известное число раз. Готовят серию разведений. Во второй части опыта из каждого разведения берут пробу для выращивания. Для подсчета числа бактерий в конкретном объеме молока используют ту пробу, где после выращивания на агаре получается наиболее подходящее число колоний (достаточно большое, но при этом отдельные колонии не перекрывают друг друга).

Материалы и оборудование

Шесть стерильных чашек с питательным агаром

Восемь градуированных пипеток на 1 см³

Градуированная пипетка на 10 см³

Шесть пробирок и штатив для них

Вата

Несмываемые чернила

Бунзеновская горелка

100 см³ дистиллированной воды

Свежее молоко

Несвежее молоко

70%-ный спирт

Алюминиевая фольга

Стеклянный шпатель

Стерилизация оборудования

1. Все шесть пробирок закройте ватными пробками, обернутыми алюминиевой фольгой.

2. Все восемь градуированных пипеток на 1 см³ и одну градуированную пипетку на 10 см³ закройте сверху небольшим комочком ваты и заверните каждую пипетку отдельно в алюминиевую фольгу.

3. Положите пробирки и пипетки в суховоздушный термостат, нагретый до 160°С, и оставьте их там на 60 мин. (В таком термостате нельзя стерилизовать бутыли со средой и водой.)

4. Перед использованием дайте оборудованию остыть.

Серийное разведение молока и посев клеток на чашки с агаром

1. Подпишите шесть стерильных, закрытых пробками пробирок, пометив их C1, C2, С3 и H1, H2, Н3. Снимите с пробок обертку из фольги.

2. Подпишите снизу шесть стерильных чашек с питательным агаром, обозначив их C1, C2, С3 и H1, H2, Н3.

3. В каждую из шести пробирок внесите по 9,9 см³ стерильной дистиллированной воды. Для этого воспользуйтесь следующими приемами.

а) Мизинцем и безымянным пальцем одной руки зажмите ватную пробку колбы со стерильной дистиллированной водой и выньте ее из колбы.

б) Одной рукой держите колбу и пробку, а в другую возьмите стерильную пипетку на 10 см³ и наберите из колбы 9,9 см³ стерильной дистиллированной воды.

в) Закройте колбу пробкой.

г) Точно таким же способом, как в пункте а, выньте пробку из первой пробирки.

д) Перенесите 9,9 см³ воды в эту пробирку.

е) Закройте пробирку пробкой.

ж) Проделайте эту же операцию с остальными пятью пробирками.

4. Хорошо встряхните пробу свежего молока и, взяв стерильную пипетку на 1 см³, перенесите 0,1 см³ такого молока в пробирку С1. Пробку вынимают и помещают обратно так же, как и раньше. Получается разведение в 100 раз.

5. Чтобы проба хорошо перемешалась, осторожно встряхните пробирку.

6. Возьмите новую пипетку и перенесите 0,1 см³ из пробирки С1 на стерильную чашку, помеченную С1, лишь слегка приподнимая крышку чашки.

7. Простерилизуйте стеклянный шпатель; для этого окуните его в 70%-ный спирт, дайте избытку спирта стечь и затем подержите вертикально в пламени бунзеновской горелки.

8. Дайте шпателю остыть и холодным шпателем размажьте пробу по поверхности чашки.

9. Снова простерилизуйте шпатель.

10. Взяв ту же пипетку, что использовалась в п. 6, перенесите 0,1 см³ из пробирки С1 в пробирку С2, вынимая и возвращая ватные пробки на место, как указано выше.

11. Чтобы проба хорошо перемешалась, встряхните пробирку С2. Получается разведение в 10000 раз.

12. Повторите все операции, начиная с п. 6 и кончая п. 9, взяв вместо С1 пробирку С2.

13. Повторите операции пп. 10 и 11, взяв С3 вместо С2. Это даст нам разведение в 1000000 раз. Повторите операции пп. 6-9, взяв С3 вместо С1.

14. Тем же методом посева штрихом приготовьте пробы несвежего молока, взяв чашки H1, H2 и Н3.

15. Переверните приготовленные чашки (шесть штук) вверх дном и поставьте примерно на 3 сут. в термостат при 35°С.

16. Затем приклейте липкой лентой крышки к чашкам, чтобы избежать возможного распространения патогенных микроорганизмов.

17. Оцените рост бактерий на чашках. Подсчитайте, где удастся, число индивидуальных колоний. Запишите полученные результаты в виде таблицы и рассчитайте по ним число бактерий в 1 см³ неразбавленного молока.

Примечание

Посмотрите примечания 3 и 4 в конце описания опыта 2.1.