Опыт 2.2. Окрашивание бактерий для изучения их с помощью светового микроскопа

Фазово-контрастный микроскоп позволяет видеть живые клетки, однако чаще все же клетки предварительно фиксируют и окрашивают. Одна из основных методик окрашивания, позволяющая идентифицировать бактерии, - это методика окрашивания по Граму. Этот метод разработал в 1884 г. датский врач Христиан Грам. До окрашивания все клетки бесцветны. После окрашивания грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый, а грамотрицательные - в красный цвет. Мы уже говорили в разд. 2.2.2 ("Клеточная стенка"), чем эти бактерии отличаются друг от друга.

Материалы и оборудование

Основной краситель - кристаллический фиолетовый (0,5%-ный водный раствор)

Раствор Люголя

Ацетон - спирт (ацетон: абсолютный спирт в соотношении 50:50) для отмывания красителя

Сафранин (1%-ный водный раствор) для контрастирования

Проволочная петля

Бунзеновская горелка

Тщательно вымытые предметные стекла (протереть спиртом)

Пинцет

Штатив для окрашивания, пристроенный над кюветой или чашкой

Промывалка с дистиллированной водой

Фильтровальная бумага

Иммерсионное масло и микроскоп с иммерсионным объективом

Методика

(Стадии 1-6 должны занять не более 5 мин.) (Из кн.: Bacteriology, Humphries, J., John Murray, 1974.)

1. Приготовьте мазок бактерий на предметном стекле. Для этого прокалите проволочную петлю в пламени горелки и охладите ее. Капните 1-2 капли водопроводной воды в центр чистого стекла. Слегка коснитесь петлей выбранной вами бактериальной колонии, полученной в предыдущем опыте; чтобы не загрязнить культуру, чашку приоткрывайте как можно меньше. Перенесите клетки на предметное стекло и осторожно помешайте каплю петлей. Размажьте клетки в виде тонкой пленки по стеклу, чтобы получилось пятно площадью около 3×1 см. Снова прокалите петлю. Очень важно добиться нужной толщины мазка. Мазок должен чуть-чуть опалесцировать и чаще оказывается слишком толстым, а не слишком тонким. Необходимо также, чтобы толщина мазка по всей поверхности была одинакова. Дайте мазку полностью высохнуть на воздухе (несколько минут).

2. Зафиксируйте мазок. Возьмите стекло пинцетом и в горизонтальном положении проведите его три раза через желтую часть пламени горелки. Очень важно не перегреть стекло. Простейший способ проверки правильности нагрева - после каждого проведения через пламя слегка коснуться стеклом руки. Если неприятного ощущения нет, то все делается верно. При фиксации бактериальные клетки гибнут в результате коагуляции цитоплазмы; кроме того, клетки прилипают к стеклу.

3. При окрашивании очень легко запачкать стол, поэтому процедуру лучше проводить на штативе, пристроенном над кюветой или кристаллизатором. Штатив можно сделать из двух стеклянных или металлических палочек, положенных строго горизонтально на края кюветы или кристаллизатора на расстоянии 5 см друг от друга. Всю систему проще всего настроить, если закрепить палочки пластилином. Залейте стекло раствором кристаллического фиолетового и оставьте на 30 с.

4. Смойте краситель раствором Люголя; залейте стекло этим раствором и оставьте на 30 с. Смойте йод дистиллированной водой из промывалки.

5. Промойте стекло смесью ацетона со спиртом, пока не перестанет отходить краситель (примерно 3 с); после этого немедленно промойте стекло водой, чтобы препарат совсем не обесцветился. Если нужно, повторите эту процедуру (умение определять продолжительность отмывки приходит с опытом).

6. Залейте стекло сафранином и оставьте на 1 мин. Отмойте краситель водой. Осторожно просушите стекло между слоями чистой фильтровальной бумаги и дайте ему окончательно высохнуть на воздухе.

7. Капните на мазок каплю иммерсионного масла и рассмотрите препарат с помощью иммерсионного объектива (разд. П.2.3.2).

Результаты

Совпадают ли ваши наблюдения с тем, что написано в разд. 2.7.1 о численности бактерий в молоке?