Опыт 5.2. Определение биомолекул в тканях

Биохимику часто приходится выявлять присутствие тех или иных биомолекул в живых тканях или определять их количество (т. е. вести качественный или количественный анализ). Иногда эти определения можно выполнять непосредственно на самой ткани, но нередко им должен предшествовать тот или иной процесс экстракции или очистки.

Полезно потренироваться на каких-нибудь обычных пищевых продуктах или растительном материале, определяя в них те биомолекулы, о которых шла речь в опыте 5.1. Там, где это возможно, мы предлагаем процедуру экстрагирования, которая позволит использовать для анализа чистый бесцветный раствор. Усвоив смысл таких процедур, студент сможет затем при необходимости сам предложить аналогичные методики.

Материалы и оборудование

Все, что перечислено в опыте 5.1 (от начала и до раствора ДХФИФ)

Ступка с пестиком

Микроскоп

Предметные и покровные стекла

Лезвие бритвы

Часовое стекло

Раствор Шульца

Флороглюцин + концентрированная соляная кислота

Клубень картофеля

Яблоко

Вата

Одревесневший стебель

Семена/орехи

Намоченный горох

Бобы

Микроскопическое исследование тонких срезов ткани

Метод пригоден для знакомства с теми отложениями запасных веществ, которые можно видеть под микроскопом, например с крахмальными зернами в клубне картофеля.

Микроскопическое исследование срезов с соответствующим окрашиванием или какой-либо иной химической обработкой

Пригодно для выявления перечисленных ниже веществ.

Редуцирующие сахара. Поместить срез в несколько капель реактива Бенедикта и осторожно нагреть до кипения; при необходимости добавить воды, чтобы предотвратить высыхание.

Крахмал. Поместить в разбавленный раствор 12/КΙ.

Белок. Поместить срез в несколько капель реактива Миллона и осторожно нагреть до кипения; при необходимости добавить воды, чтобы предотвратить высыхание.

Масла и жиры. Окрасить исследуемый материал, например семена, Суданом III, после чего промыть водой и (или) 70%-ным спиртом. Приготовить срезы и заключить в среду.

Целлюлоза, лигнин и т. п. Об окрашивании см. Приложение 2.4.2.

Исследование прозрачных водных растворов

Обесцветить ткань, если в этом есть необходимость. Присутствующие в ткани пигменты могут мешать цветным реакциям, но обычно эти пигменты легко удалить из ткани органическими растворителями, например 80%-ным этанолом или 80%-ным пропаном (Беречь от соприкосновения с открытым огнем!). Следует, однако, помнить, что эти растворители могут удалять из ткани липиды и растворимые сахара.

Способ пригоден для извлечения хлорофилла из листьев.

Гомогенизация материала. Сахара и белки. Кусочки предназначенного для исследования материала растереть в кашицу с небольшим количеством воды при помощи ступки или миксера. Растертый материал процедить через несколько слоев тонкой кисеи или нейлона, предварительно смоченных водой, и (или) отфильтровать либо отцентрифугировать для удаления твердых частиц. Это может и не потребоваться, если суспензия окажется высокодисперсной и практически бесцветной. Прозрачный раствор анализируют, как обычно, а если нужно, приготовляют из него соответствующие разведения. Твердый осадок, если он представляет интерес, также может быть подвергнут анализу.

Липиды. Растереть материал, перенести в пробирку и вскипятить. Липиды отделяются в виде капелек масла. Провести окрашивание Суданом III. Можно вместо этого приготовить эмульсию из тонко наструганного ядра ореха или других пищевых продуктов (которые могут быть и окрашенными) и провести эмульсионную пробу.

Описанная методика пригодна для выявления в различных материалах указанных ниже веществ: Фрукты (например, яблоки (витамин С, сахара) или апельсины)

Орехи (масла)

Семена клещевины (масло)

Семена гороха (белок)

Семена сосны (белок, масло)

Картофель (крахмал, витамин С)

Яйца (белок)

Исследуемые материалы можно подразделить на фракции и затем каждую такую фракцию, например семена, мякоть плодов, кожуру или сок, исследовать по отдельности.