Глава 5. Влияние факторов окружающей среды на микроорганизмы - Н. А. Бельская

Жизнь микроорганизмов находится в тесной зависимости от условий окружающей среды. Все факторы окружающей среды, оказывающие влияние на микроорганизмы, можно разделить на три группы: физические, химические и биологические, благоприятное или губительное действие которых зависит как от природы самого фактора, так и от свойств микроорганизма.

Физические факторы

Из физических факторов наибольшее влияние на развитие микроорганизмов оказывают температура, высушивание, лучистая энергия, ультразвук.

Температура. Жизнедеятельность каждого микроорганизма ограничена определенными температурными границами. Эту температурную зависимость обычно выражают тремя основными точками: минимум - температура, ниже которой размножение микробных клеток прекращается; оптимум - наилучшая температура для роста и развития микроорганизмов; максимум - температура, выше которой жизнедеятельность клеток ослабляется или прекращается. Оптимальная температура обычно соответствует температурным условиям естественной среды обитания.

Все микроорганизмы по отношению к температуре подразделяются на психрофилы, мезофилы и термофилы.

Психрофилы (от греч. psychros - холодный, phileo - люблю), или холодолюбивые микроорганизмы, растут при относительно низких температурах: минимальная температура - 0° С, оптимальная - 10-20° С, максимальная - 30° С. Эта группа включает микроорганизмы, обитающие в северных морях и океанах, почве, сточных водах. Сюда же относятся светящиеся и железобактерии, а также микробы, вызывающие порчу продуктов на холоду (ниже 0° С).

Мезофилы (от греч. mesos - средний) - наиболее обширная группа, включающая большинство сапрофитов и все патогенные микроорганизмы. Оптимальная температура для них 28-37° С, минимальная - 10° С, максимальная - 45° С.

Термофилы (от греч. termos - тепло, жар), или теплолюбивые микроорганизмы, развиваются при температуре выше 55° С, температурный минимум для них 30° С, оптимум - 50-60° С, а максимум - 70-75° С. Они встречаются в горячих минеральных источниках, поверхностном слое почвы, самонагревающихся субстратах (навозе, сене, зерне), кишечнике человека и животных. Среди термофилов много споровых форм.

Высокие и низкие температуры оказывают различное влияние на микроорганизмы. Одни более чувствительны к высоким температурам. Причем, чем выше температура за пределами максимума, тем быстрее наступает гибель микробных клеток, что обусловлено денатурацией (свертыванием) белков клетки.

Вегетативные формы бактерий мезофилов погибают при температуре 60° С в течение 30-60 мин, а при 80-100° С - через 1-2 мин. Споры бактерий гораздо устойчивее к высоким температурам. Например, споры бацилл сибирской язвы выдерживают кипячение в течение 10-20 мин, а споры клостридий ботулизма - 6 ч. Все микроорганизмы, включая споры, погибают при температуре 165-170° С в течение часа (в сухожаровом шкафу) или при действии пара под давлением 1 атм (в автоклаве) в течение 30 мин.

Действие высоких температур на микроорганизмы положено в основу стерилизации - полного освобождения разнообразных объектов от микроорганизмов и их спор (см. ниже).

К действию низких температур многие микроорганизмы чрезвычайно устойчивы. Сальмонеллы тифа и холерный вибрион длительно выживают во льду. Некоторые микроорганизмы остаются жизнеспособными при температуре жидкого воздуха (-190° С), а споры бактерий выдерживают температуру до -250° С.

Только отдельные виды патогенных бактерий чувствительны к низким температурам (например, бордетеллы коклюша и паракоклюша, нейссерии менингококка и др.). Эти свойства микроорганизмов учитывают в лабораторной диагностике и при транспортировке исследуемого материала - его доставляют в лабораторию защищенным от охлаждения.

Действие низких температур приостанавливает гнилостные и бродильные процессы, Что широко применяется для сохранения пищевых продуктов в холодильных установках, погребах, ледниках. При температуре ниже 0° С микробы впадают в состояние анабиоза - наступает замедление процессов обмена веществ и прекращается размножение. Однако при наличии соответствующих температурных условий и питательной среды жизненные функции микробных клеток восстанавливаются. Это свойство микроорганизмов используется в лабораторной практике для сохранения культур микробов при низких температурах. Губительное действие на микроорганизмы оказывает также быстрая смена высоких и низких температур (замораживание и оттаивание) - это приводит к разрыву клеточных оболочек.

Высушивание. Для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов необходима вода. Высушивание приводит к обезвоживанию цитоплазмы, нарушению целостности цитоплазматической мембраны, вследствие чего нарушается питание микробных клеток и наступает их гибель.

Сроки отмирания разных видов микроорганизмов под влиянием высушивания значительно отличаются. Так, например, патогенные нейссерии (менингококки, гонококки), лептоспиры, бледная трепонема и другие погибают при высушивании через несколько минут. Холерный вибрион выдерживает высушивание 2 сут, сальмонеллы тифа - 70 сут, а микобактерии туберкулеза - 90 сут. Но высохшая мокрота больных туберкулезом, в которой возбудители защищены сухим белковым чехлом, остается заразной 10 мес.

Особой устойчивостью к высушиванию, как и к другим воздействиям окружающей среды, обладают споры. Споры бацилл сибирской язвы сохраняют способность к прорастанию в течение 10 лет, а споры плесневых грибов - до 20 лет.

Неблагоприятное действие высушивания на микроорганизмы издавна используется для консервирования овощей, фруктов, мяса, рыбы и лекарственных трав. В то же время, попав в условия повышенной влажности, такие продукты быстро портятся из-за восстановления жизнедеятельности микробов.

Для хранения культур микроорганизмов, вакцин и других биологических препаратов широко применяют метод лиофильной сушки. Сущность метода состоит в том, что предварительно микроорганизмы или препараты подвергают замораживанию, а затем их высушивают в условиях вакуума. При этом микробные клетки переходят в состояние анабиоза и сохраняют свои биологические свойства в течение нескольких месяцев или лет.

Лучистая энергия. В природе микроорганизмы постоянно подвергаются воздействию солнечной радиации. Прямые солнечные лучи вызывают гибель многих микроорганизмов в течение нескольких часов, за исключением фотосинтезирующих бактерий (зеленых и пурпурных серобактерий). Губительное действие солнечного света обусловлено активностью ультрафиолетовых лучей (УФ-лучи). Они инактивируют ферменты клетки и повреждают ДНК. Патогенные бактерии более чувствительны к действию УФ-лучей, чем сапрофиты. Поэтому хранить микробные культуры в лаборатории лучше в темноте. В этом отношении демонстративен опыт Бухнера.

В чашку Петри с тонким слоем агара производят обильный посев какой-либо культуры бактерий. На наружную поверхность засеянной чашки наклеивают вырезанные из черной бумаги буквы, образующие, например, слово "typhus". Чашку, обращенную дном вверх, подвергают облучению прямыми солнечными лучами в течение 1 ч. Затем бумажки снимают, и чашку ставят на сутки в термостат при 37° С. Рост бактерий наблюдается лишь в тех местах агара, которые были защищены от действия УФ-лучей наклеенными буквами. Остальная часть агара остается прозрачной, т. е. рост микроорганизмов отсутствует (рис. 11).

Рис. 11. Действие света на бактерии

Велико значение солнечного света как естественного фактора оздоровления внешней среды. Он освобождает от патогенных бактерий воздух, воду "естественных водоемов, верхние слои почвы.

Бактерицидное (уничтожающее бактерий) действие УФ-лучей используется для стерилизации воздуха закрытых помещений (операционных, перевязочных, боксов и т. д.), а также воды и молока. Источником этих лучей являются лампы ультрафиолетового излучения, бактерицидные лампы.

Другие виды лучистой энергии - рентгеновские лучи, α-, β-, γ-лучи оказывают губительное действие на микроорганизмы только в больших дозах, порядка 440-280 Дж/кг. Гибель микробов обусловлена разрушением ядерных структур и клеточной ДНК. Малые дозы излучений стимулируют рост микробных клеток. Микроорганизмы значительно устойчивее к радиоактивным излучениям, чем высшие организмы. Известны тионовые бактерии, обитающие в залежах урановых руд. Бактерии обнаруживали в воде атомных реакторов при концентрации ионизирующей радиации 20-30 кДж/кг.

Бактерицидное действие ионизирующего излучения используется для консервирования некоторых пищевых продуктов, стерилизации биологических препаратов (сывороток, вакцин и др.), при этом свойства стерилизуемого материала не изменяются.

В последние годы радиационным методом стерилизуют изделия для одноразового использования - полистироловые пипетки, чашки Петри, лунки для серологических реакций, шприцы, а также шовный материал - кетгут и др.

Ультразвук вызывает значительное поражение микробной клетки. Под действием ультразвука газы, находящиеся в жидкой среде цитоплазмы, активируются, и внутри клетки возникает высокое давление (до 10000. атм). Это приводит к разрыву клеточной оболочки и гибели клетки. Ультразвук используют для стерилизации пищевых продуктов (молока, фруктовых соков), питьевой воды.

Высокое давление. К механическому давлению бактерии и особенно их споры устойчивы. В природе встречаются бактерии, живущие в морях и океанах на глубине 1000-10000 м под давлением от 100 до 900 атм. Некоторые виды бактерий выдерживают давление до 3000-5000 атм, а бактериальные споры - даже 20000 атм.

Химические факторы

Влияние химических веществ на микроорганизмы различно в зависимости от природы химического соединения, его концентрации, продолжительности воздействия на микробные клетки. В зависимости от концентрации химическое вещество может быть источником питания или оказывать угнетающее действие на жизнедеятельность микроорганизмов. Например, 0,5-2% раствор глюкозы стимулирует рост микробов, а 20-40% растворы глюкозы задерживают размножение микробных клеток.

Многие химические соединения, оказывающие губительное действие на микроорганизмы, используются в медицинской практике в качестве дезинфицирующих веществ и антисептиков.

Химические вещества, используемые для дезинфекции, называют дезинфицирующими. Под дезинфекцией понимают мероприятия, направленные на уничтожение патогенных микроорганизмов в различных объектах окружающей среды. К дезинфицирующим веществам относят галлоидные соединения, фенолы и их производные, соли тяжелых металлов, некоторые кислоты, щелочи, спирты и др. Они вызывают гибель микробных клеток, действуя в оптимальных концентрациях, в течение определенного времени. Многие дезинфицирующие вещества оказывают вредное воздействие на ткани макроорганизма.

Антисептиками называют химические вещества, которые могут вызывать гибель микроорганизмов или задерживать их рост и размножение. Их используют с лечебной целью (химиотерапия), а также для обеззараживания ран, кожи, слизистых оболочек человека. Антисептическими свойствами обладают перекись водорода, спиртовые растворы йода, бриллиантового зеленого, растворы перманганата калия и др. Некоторые антисептические вещества (уксусная, сернистая, бензойная кислоты и др.) в дозах, безвредных для человека, применяют для консервирования пищевых продуктов.

По механизму действия химические вещества, обладающие противомикробной активностью, можно подразделить на несколько групп.

1. Поверхностно-активные вещества (жирные кислоты, мыла и прочие детергенты) вызывают снижение поверхностного натяжения, что приводит к нарушению функционирования клеточной стенки и цитоплазматической мембраны микроорганизмов.

2. Фенол, крезол и их производные вызывают коагуляцию микробных белков. Они используются для дезинфекции заразного материала в микробиологической практике и инфекционных больницах.

3. Окислители, взаимодействуя с микробными белками, нарушают деятельность ферментов, вызывают денатурацию белков. Активными окислителями являются хлор, озон, которые используют для обеззараживания питьевой воды. Хлорпроизводные вещества (хлорная известь, хлорамин) широко употребляют в целях дезинфекции. Окисляющими свойствами обладают перекись водорода, перманганат калия, йод и др.

4. Формальдегид применяют в виде 40% раствора (формалин) для дезинфекции. Он убивает вегетативные и споровые формы микроорганизмов. Формалин блокирует аминогруппы белков микробной клетки и вызывает их денатурацию.

5. Соли тяжелых металлов (ртуть, свинец, цинк, золото и др.) коагулируют белки микробной клетки, вызывая этим их гибель. Ряд металлов (серебро, золото, ртуть и др.) оказывают бактерицидное действие на микроорганизмы в ничтожно малых концентрациях. Это свойство получило название олигодинамического действия (от лат. oligos - малый, dinamys - сила). Доказано, что вода, находящаяся в сосудах из серебра, не загнивает, благодаря бактерицидному действию ионов серебра. Для профилактики бленнореи^* новорожденных долгое время применяли 1% раствор нитрата серебра. Коллоидные растворы органических соединений серебра (протаргол, колларгол) используют также в виде местных антисептических средств.

^* (Бленнорея - воспаление конъюнктивы глаза, вызванное гонококками.)

Сильным антимикробным действием обладают препараты ртути. Издавна для дезинфекции применяли бихлорид ртути, или сулему (в разведении 1:1000). Однако она оказывает токсическое действие на ткани макроорганизма и использование ее ограничено.

6. Красители (бриллиантовый зеленый, риванол и др.) обладают свойством задерживать рост бактерий. Растворы ряда красителей применяют в качестве антисептических средств, а также вводят в состав некоторых питательных сред для угнетения роста сопутствующей микрофлоры.

Губительное действие ряда физических и химических факторов на микроорганизмы составляет основу асептического и антисептического методов, широко используемых в медицинской и санитарной практике.

Асептика - система профилактических мероприятий, препятствующих микробному загрязнению объекта (раны, операционного поля, культур микроорганизмов и т. д.), основанная на физических методах.

Антисептика - комплекс мер, направленных на уничтожение микроорганизмов в ране, целом организме или на объектах внешней среды, с применением различных обеззараживающих химических веществ.

Биологические факторы

В естественных условиях обитания микроорганизмы существуют не изолированно, а находятся в сложных взаимоотношениях, которые сводятся в основном к симбиозу, метабиозу и антагонизму.

Симбиоз - это сожительство организмов различных видов, приносящих им взаимную пользу. При этом совместно они развиваются лучше, чем каждый из них в отдельности.

Симбиотические взаимоотношения существуют между клубеньковыми бактериями и бобовыми растениями, между мицелиальными грибами и сине-зелеными водорослями (лишайниками): Симбиоз молочно-кислых бактерий и спиртовых дрожжей используют для приготовления некоторых молочно-кислых продуктов (кефир, кумыс).

Метабиоз - такой вид взаимоотношений, при котором продукты обмена одного вида микроорганизмов создают необходимые условия для развития других. Например, гнилостные микроорганизмы, расщепляющие белковые вещества, способствуют накоплению в среде аммонийных соединений и создают благоприятные условия для роста и развития нитрифицирующих бактерий. А развитие анаэробов в хорошо аэрируемой почве было бы невозможно без аэробов, поглощающих свободный кислород.

Метабиотические взаимоотношения широко распространены среди почвенных микроорганизмов и лежат в основе круговорота веществ в природе.

Антагонизм - форма взаимоотношений, при которой один микроорганизм угнетает развитие другого или может вызвать его полную гибель. Антагонистические взаимоотношения выработались у микроорганизмов в борьбе за существование. Повсюду, где они обитают, между ними идет непрерывная борьба за источники питания, кислород воздуха, среду обитания. Так, большинство патогенных бактерий, попав с выделениями больных во внешнюю среду (почву, воду), не выдерживают здесь длительной конкуренции с многочисленными сапрофитами и сравнительно быстро погибают.

Антагонизм может быть обусловлен прямым воздействием микроорганизмов друг на друга или действием продуктов их обмена. Например, простейшие пожирают бактерий, а фаги лизируют их. Кишечник новорожденных заселяют молочно-кислые бактерии Bifidobacterium bifidum. Выделяя молочную кислоту, они подавляют рост гнилостных бактерий и этим защищают от кишечных Расстройств еще малоустойчивый организм грудных детей. Некоторые микроорганизмы в процессе жизнедеятельности вырабатывают различные вещества, оказывающие губительное действие на бактерии и другие микробы. К таким веществам относят антибиотики (см. "Антибиотики").

Контрольные вопросы

1. Какие физические факторы оказывают влияние на жизнедеятельность микроорганизмов?

2. Какие вещества относит к дезинфицирующим и как они различаются по механизму воздействия на микроорганизмы?

3. Перечислите, какие взаимоотношения существуют между микроорганизмами?

Стерилизация

Стерилизация - это обеспложивание, т. е. полное освобождение объектов окружающей среды от микроорганизмов и их спор.

Стерилизацию производят различными способами:

1) физическими (воздействие высокой температуры, УФ-лучей, использование бактериальных фильтров);

2) химическими (использование различных дезинфектантов, антисептиков);

3) биологическим (применение антибиотиков).

В лабораторной практике обычно применяют физические способы стерилизации.

Возможность и целесообразность использования того или иного способа стерилизации обусловлена особенностями материала, подлежащего стерилизации, его физическими и химическими свойствами.

Физические способы

Прокаливание в пламени горелки или фламбирование - способ стерилизации, при котором происходит полное обеспложивание объекта, так как погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Обычно прокаливают бактериологические петли, шпатели, пипетки, предметные и покровные стекла, мелкие инструменты. Не следует стерилизовать прокаливанием ножницы, скальпели, так как под действием огня режущая поверхность становится тупой.

Сухожаровая стерилизация

Стерилизацию сухим жаром или горячим воздухом осуществляют в печах Пастера (сушильных сухожаровых шкафах). Печь Пастера - шкаф с двойными стенками, изготовленный из термостойких материалов - металла и асбеста. Нагревают шкаф с помощью газовых горелок или электронагревательных приборов. Шкафы с электрическим нагревом снабжены регуляторами, обеспечивающими необходимую температуру. Для контроля температуры имеется термометр, вставленный в отверстие верхней стенки шкафа.

Сухим жаром стерилизуют в основном лабораторную Посуду. Подготовленную для стерилизации посуду неплотно загружают в печь, чтобы обеспечить равномерный и надежный прогрев стерилизуемого материала. Дверь шкафа плотно закрывают, включают обогревательный прибор, доводят температуру до 160-165° С и при этой температуре стерилизуют 1 ч. По окончании стерилизации выключают обогрев, но дверцу шкафа не открывают до тех пор, пока печь не остынет; в противном случае холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде.

Стерилизацию в печи Пастера можно проводить при различном температурном режиме и экспозиции (время стерилизации) (табл. 1).

Таблица 1. Режим стерилизации

Жидкости (питательные среды, изотонический раствор хлорида натрия и др.), предметы из резины и синтетических материалов стерилизовать сухим жаром нельзя, так как жидкости вскипают и выливаются, а резина и синтетические материалы плавятся.

Для контроля стерилизации в печи Пастера шелковые нити смачивают в культуре спорообразующих бактерий, подсушивают, помещают в стерильную чашку Петри и ставят в печь Пастера. Стерилизацию проводят при температуре 165° С 1 ч (для контроля часть нитей оставляют при комнатной температуре). Затем простерилизованные и контрольные нити кладут на поверхность агара в чашку Петри или помещают в пробирки с бульоном и инкубируют в термостате при температуре 37° С в течение 2 сут. При правильной работе печи Пастера в пробирках или чашках с питательными средами, куда были помещены простерилизованные нити, роста не будет, так как споры бактерий погибнут, в то время как споры бактерий на нитях, не подвергавшихся стерилизации (контрольные), прорастут и на питательных средах будет отмечен рост.

Для определения температуры внутри печи Пастера можно использовать сахарозу или пищевой сахарный песок, карамелизующиеся при температуре 165-170° С.

Подготовка лабораторной посуды к стерилизации в печи Пастера. Лабораторную посуду (чашки Петри, пипетки градуированные и пастеровские, флаконы, колбы, пробирки) перед стерилизацией необходимо тщательно вымыть, высушить и завернуть в бумагу, иначе после стерилизации она может снова загрязниться бактериями воздуха.

Чашки Петри завертывают в бумагу по одной или несколько штук либо укладывают в специальные металлические пеналы.

В верхние концы пипеток вставляют ватные тампоны, предупреждающие попадание исследуемого материала в рот. Градуированные пипетки заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4-5 см. На бумаге отмечают объем завернутой пипетки. В пеналах градуированные пипетки стерилизуют без дополнительного завертывания в бумагу.

Примечание. Если градуировка на пипетках плохо заметна, ее восстанавливают перед стерилизацией. На пипетку наносят масляную краску и, не дав краске высохнуть, в нее втирают с помощью тряпочки порошок бария сульфата. После этого тряпкой снимают избыток краски, которая остается только в насечках градуировки. Обработанные таким образом пипетки следует сполоснуть.

Острые концы пастеровских пипеток запаивают в пламени горелки и заворачивают в бумагу по 3-5 штук. Заворачивать пастеровские пипетки нужно осторожно, чтобы не обломать запаянные концы капилляров.

Флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Пробка должна входить в горлышко сосуда на ²/₃ своей длины, не слишком туго, но и не свободно. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок. Пробирки связывают по 5-50 штук и обертывают поверх бумагой.

Примечание. При высоких температурах бумага, в которую завертывают чашки и пипетки, и вата желтеют и даже могут обугливаться, поэтому каждый новый сорт бумаги, получаемый лабораторией, следует испытывать при принятом температурном режиме.

Контрольные вопросы

1. Что понимают под термином стерилизация?

2. Какими способами проводят стерилизацию?

3. Что стерилизуют прокаливанием на огне?

4. Опишите устройство и режим работы печи Пастера.

5. Что стерилизуют в печи Пастера?

6. Как подготавливают стеклянную посуду к стерилизации?

7. Почему в печи Пастера нельзя стерилизовать питательные среды и предметы из резины?

Задание

Подготовьте к стерилизации чашки Петри, градуированные пипетки, пастеровские пипетки, пробирки, колбы и флаконы.

Стерилизация кипячением

Кипячение - способ стерилизации, гарантирующий обеспложивание при условии отсутствия в стерилизуемом материале спор. Применяют для обработки шприцев инструментов, стеклянной и металлической посуды резиновых трубок и т. п.

Стерилизацию кипячением обычно проводят в стерилизаторе - металлической коробке прямоугольной формы с плотно закрывающейся крышкой. Стерилизуемый материал помещают на имеющуюся в стерилизаторе сетку и заливают водой. Для повышения точки кипения и устранения жесткости воды добавляют 1-2% гидрокарбонат натрия (лучше пользоваться дистиллированной водой). Стерилизатор закрывают крышкой и подогревают Началом стерилизации считают момент закипания воды, время кипячения 15-30 мин. По окончании стерилизации сетку с инструментами извлекают за боковые ручки специальными крючками, а находящиеся в ней инструменты берут стерильным пинцетом или корнцангом, который кипятят вместе с остальными инструментами.

Стерилизацию паром производят двумя способами: 1) паром под давлением; 2) текучим паром.

Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Этот способ стерилизации основан на воздействии на стерилизуемые материалы насыщенного водяного пара при давлении выше атмосферного. В результате такой стерилизации при однократной обработке погибают как вегетативные, так и споровые формы микроорганизмов.

Автоклав (рис. 12) - массивный котел, снаружи покрытый металлическим кожухом, герметически закрыт крышкой, которая плотно привинчивается к котлу откидывающимися болтами. В наружный котел вставлен другой, меньшего диаметра, который называют стерилизационной камерой. В эту камеру помещают предметы, подлежащие стерилизации. Между обоими котлами имеется свободное пространство, называемое водопаровой камерой. В эту камеру через воронку, укрепленную снаружи, наливают воду до определенного уровня, отмеченного на специальной водомерной трубке. При кипячении воды в водопаровой камере образуется пар. Стерилизационная камера снабжена выпускным краном с предохранительным клапаном для выхода пара при повышении давления сверх необходимого. Для определения давления, создающегося в стерилизационной камере, служит манометр.

Рис. 12. Схема автоклава. М - манометр; ПК - предохранительный клапан; В - воронка для воды; К₂ - кран для выпуска воды; К₃ - кран для выпуска пара

Нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимают за нуль. Между показаниями манометра и температурой имеется определенная зависимость (табл. 2).

Таблица 2. Режим работы автоклава

В настоящее время имеются автоклавы с автоматическим регулированием режима работы. Кроме обычного манометра, они снабжены электроконтактным манометром, который препятствует увеличению давления выше заданной величины и тем самым обеспечивает постоянство нужной температуры в автоклаве.

Паром под давлением стерилизуют различные питательные среды (кроме содержащих нативные белки), жидкости (изотонический раствор хлорида натрия, воду и т. д.); приборы, особенно имеющие резиновые части.

Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяется их составом, указанным в рецепте приготовления питательной среды. Например, простые среды (мясопептонный агар, мясопептонный бульон) стерилизуют 20 мин при 120° С (1 атм). Однако при этой температуре нельзя стерилизовать среды, содержащие нативные белки, углеводы и другие легко изменяющиеся от нагревания вещества. Среды с углеводами стерилизуют дробно при 100° С или в автоклаве при 112° С (0,5 атм) 10-15 мин. Различные жидкости, приборы, имеющие резиновые шланги, пробки, бактериальные свечи и фильтры стерилизуют 20 мин при 120° С (1 атм).

Внимание! В автоклавах производят также обезвреживание инфицированного материала. Чашки и пробирки, содержащие культуры микроорганизмов, помещают в специальные металлические ведра или баки с отверстиями в крышке для проникновения пара и стерилизуют в автоклаве при 126° С (1,5 атм) в течение 1 ч. Таким же образом стерилизуют инструменты после работы с бактериями, образующими споры.

К работе с автоклавом допускаются только специально подготовленные лица, которые должны строго и точно выполнять правила, указанные в инструкции, прилагаемой к аппарату.

Техника автоклавирования. 1. Перед работой проверяют исправность всех частей и притертость кранов.

2. Через воронку, укрепленную снаружи котла, до верхней метки водомерного стекла заливают воду (дистиллированную или кипяченую, чтобы не образовалась накипь). Кран под воронкой закрывают.

3. В стерилизационную камеру на специальную сетку помещают стерилизуемый материал. Предметы следует загружать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить между ними, иначе они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными.

4. Резиновую прокладку на крышке натирают мелом для лучшей герметизации.

5. Крышку закрывают и болтами привинчивают к корпусу автоклава, причем болты закручивают попарно крест-накрест.

6. Открывают до отказа выпускной кран, соединяющий стерилизационную камеру с наружным воздухом, и начинают нагревать автоклав. Нагревание автоклава обычно производят с помощью газа или электричества.

При нагревании автоклава вода закипает, образующийся пар поднимается между стенками котлов и сквозь специальные отверстия, имеющиеся в стенке внутреннего котла (см. рис. 12), попадает в стерилизационную камеру и выходит через открытый выпускной кран. Сначала пар выходит вместе с воздухом, находившимся в автоклаве. Необходимо, чтобы весь воздух был вытеснен из автоклава, так как в противном случае показания манометра не будут соответствовать температуре в автоклаве.

Появление непрерывной сильной струи пара указывает на полное удаление воздуха из автоклава; после этого выпускной кран закрывают и давление, внутри автоклава начинает постепенно повышаться.

7. Началом стерилизации считают момент, когда показания манометра достигают заданной величины. Нагрев регулируют так, чтобы давление в автоклаве в течение определенного времени не изменялось.

8. По истечении времени стерилизации нагрев автоклава прекращают, пар выпускают через выпускной кран. Когда стрелка манометра опускается до нуля, открывают крышку. Чтобы избежать ожогов паром, оставшимся в автоклаве, крышку следует открывать на себя.

Уровень температуры в автоклаве, т. е. правильность показаний манометра, можно проверить. Для этого используют различные вещества, имеющие определенную точку плавления: антипирин (113° С), резорцин и серу (119° С), бензойную кислоту (120° С). Одно из этих веществ смешивают с ничтожно малым количеством красителя (фуксина или метиленового синего) и насыпают в стеклянную трубочку, которую запаивают и помещают в вертикальном положении между стерилизуемым материалом. Если температура достаточна, вещество расплавится и окрасится в цвет соответствующего красителя.

Для проверки эффективности стерилизации в автоклав помещают пробирку с заведомо споровой культурой. После автоклавирования пробирку переносят в термостат на 24-48 ч, отмечают отсутствие или наличие роста. Отсутствие роста свидетельствует о правильной работе прибора.

Стерилизацию текучим паром производят в аппарате Коха. Этот способ применяют в тех случаях, когда стерилизуемый объект изменяется при температуре выше 100° С. Текучим паром стерилизуют питательные среды, содержащие мочевину, углеводы, молоко, картофель, желатин и др.

Аппарат (кипятильник) Коха представляет собой металлический цилиндр, обшитый снаружи (для уменьшения теплоотдачи) войлоком или асбестом. Цилиндр закрывают конической крышкой с отверстием для выхода пара. Внутри цилиндра находится подставка, до уровня которой наливают воду. На подставку ставят ведро с отверстием, в которое помещают стерилизуемый материал. Нагревают аппарат Коха при помощи газа или электричества. Отсчет времени стерилизации ведут с момента энергичного выделения пара у краев крышки и из отверстия для выхода пара. Стерилизуют в течение 30-60 мин. По окончании стерилизации нагрев прекращают. Вынимают из аппарата ведро с материалом и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Прогревание проводят 3 дня подряд при температуре 100° С по 30-60 мин. Такой метод носит название дробной стерилизации. При первом прогревании гибнут вегетативные формы микробов, а споровые сохраняются. За сутки споры успевают прорасти и превратиться в вегетативные формы, которые погибают на второй день стерилизации. Так как возможно, что некоторая часть спор не успела прорасти, материал выдерживают еще 24 ч, а затем проводят третью стерилизацию. Стерилизация текучим паром в аппарате Коха не требует специального контроля, так как показателем правильной работы прибора служит стерильность приготовленных питательных сред. Стерилизовать текучим паром можно также в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране.

Контрольные вопросы

1. Какие питательные среды стерилизуют паром?

2. Что такое стерилизатор и как он устроен?

3. Почему при стерилизации кипячением следует применять дистиллированную воду?

4. Опишите устройство и режим работы автоклава.

5. Что стерилизуют в автоклаве?

6. Что служит контролем правильной стерилизации при автоклавировании?

7. Что такое стерилизация текучим паром?

8. Опишите устройство аппарата Коха.

9. С какой целью проводят дробную стерилизацию?

Задание

Заполните форму.

Дробную стерилизацию можно проводить также в свертывателе Коха.

Свертыватель Коха используют для свертывания сывороточных и яичных питательных сред, причем одновременно с уплотнением среды происходит ее стерилизация.

Свертыватель Коха представляет собой плоский металлический ящик с двойными стенками, покрытый снаружи теплоизоляционным материалом. В пространство между стенками через специальное отверстие, находящееся в верхней части наружной стенки, наливают воду. Отверстие закрывают пробкой, в которую вставлен термометр. Закрывают аппарат двумя крышками: стеклянной и металлической. Через стеклянную крышку можно наблюдать за процессом свертывания. Пробирки со средами укладывают на дно свертывателя в наклонном положении.

Нагревание свертывателя осуществляют с помощью газа или электричества. Среды стерилизуют однократно при температуре 90° С в течение 1 ч или дробно - 3 дня подряд при 80° С в течение 1 ч.

Тиндализацию^* - дробную стерилизацию при низких температурах - применяют для веществ, которые легко разрушаются и денатурируются при температуре 60° С (например, белковые жидкости). Прогревание стерилизуемого материала производят на водяной бане или в специальных приборах с терморегуляторами при температуре 56-58° С в течение часа 5 дней подряд.

^* (Способ стерилизации, назван по имени Тиндаля, предложившего его.)

Пастеризация - стерилизация при 65-70° С в течение 1 ч, предложена Пастером для уничтожения бесспоровых форм микробов. Пастеризуют молоко, вино, пиво, плодовые соки и другие продукты. Молоко пастеризуют с целью освобождения от молочно-кислых и патогенных бактерий (бруцеллы, микобактерии туберкулеза, шигеллы, сальмонеллы, стафилококки и др.). При пастеризации пива, плодовых соков, вина погибают микроорганизмы, вызывающие различные виды брожения. Пастеризованные продукты лучше сохранять на холоду.

Контрольные вопросы

1. Каково назначение и устройство свертывателя Коха?

2. Какие существуют способы стерилизации в свертывателе?

3. Что такое тиндализация?

4. Что такое пастеризация?

Стерилизация ультрафиолетовым облучением

Стерилизацию УФ-лучами производят при помощи специальных установок - бактерицидных ламп. УФ-лучи обладают высокой антимикробной активностью и могут вызвать гибель не только вегетативных клеток, но и спор. УФ-облучение применяют для стерилизации воздуха в больницах, операционных, детских учреждениях и т. д. В микробиологической лаборатории УФ-лучами обрабатывают бокс перед работой.

Контрольные вопросы

1. Какими свойствами обладают ультрафиолетовые лучи?

2. В каких случаях прибегают к стерилизации методом ультрафиолетового излучения?

Механическая стерилизация при помощи бактериальных фильтров

Стерилизацию фильтрованием применяют в тех случаях, когда стерилизуемые предметы изменяются при нагревании. Фильтрование проводят с помощью бактериальных фильтров, изготовленных из различных мелкопористых материалов. Поры фильтров должны быть достаточно мелкими (до 1 мкм), чтобы обеспечить механическую задержку бактерий, поэтому некоторые авторы относят фильтрование к механическим способам стерилизации.

Методом фильтрования стерилизуют питательные среды, содержащие белок, сыворотки, некоторые антибиотики, а также отделяют бактерии от вирусов, фагов и экзотоксинов.

В микробиологической практике используют асбестовые фильтры Зейтца, мембранные фильтры и фильтры (свечи) Шамберлана и Беркефельда.

Фильтры Зейтца представляют собой диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой. Толщина их 3-5 мм, диаметр 35-140 мм. Отечественная промышленность изготовляет фильтры двух марок: "Ф" (фильтрующие)- задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие бактерии; "СФ" (стерилизующие) - с меньшими порами, задерживающие бактерии, но пропускающие вирусы. Мятые асбестовые пластинки, а также пластинки с надломами и трещинами для работы непригодны.

Мембранные фильтры готовят из нитроцеллюлозы. Они представляют собой диски белого цвета толщиной 0,1 мм и диаметром 35 мм. В зависимости от размера пор их обозначают № 1, 2, 3, 4 и 5 (табл. 3).

Таблица 3. Характеристика мембранных фильтров

Для стерилизации наиболее пригоден фильтр № 1. Кроме перечисленных, выпускают еще так называемый предварительный фильтр, предназначенный для освобождения фильтруемой жидкости от содержащихся в ней крупных частиц.

Фильтры (свечи) Шамберлана и Беркефельда представляют собой полые цилиндры, закрытые с одного конца. Свечи Шамберлана изготовляют из каолина с примесью песка и кварца. Стандартизуют их по размерам пор и обозначают L₁, L₂, L₃ ... L₁₃. Фильтры (свечи) Беркефельда готовят из инфузорной земли, по величине пор их обозначают V, N, W, что соответствует диаметру пор 3-4, 4-7, 8-12 мк.

Работу с бактериальными фильтрами осуществляют следующим образом. Фильтр должен быть закреплен в специальном держателе, который вставляют в приемник фильтра. Приемником обычно является колба Бунзена. Держатели, в большинстве случаев сделанные из нержавеющей стали, состоят из двух частей: верхней, имеющей форму цилиндра без дна, и нижней - опорной части, заканчивающейся трубкой. Фильтры Зейтца шероховатой поверхностью вверх помещают на металлическую сетку и крепко зажимают винтами между верхней и нижней частью держателя. Смонтированный фильтр укрепляют в резиновой пробке, вставленной в горлышко колбы Бунзена. В отводную трубку колбы, которую присоединяют к вакуумному насосу, вставляют ватный тампон. Подготовленную установку обертывают бумагой и стерилизуют в автоклаве под давлением 1 атм в течение 20-30 мин. Весь прибор в собранном виде называют также фильтром Зейтца (рис. 13).

Рис. 13. Фильтр Зейтца

Непосредственно перед фильтрованием отводной конец колбы Бунзена соединяют резиновой трубкой с масляным или водоструйным насосом. Места соединения различных частей заливают парафином для создания герметичности. В цилиндр аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают в действие насос, создающий вакуум в приемнике. В результате образующейся разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приемник, а микробы остаются на поверхности фильтра.

Мембранные фильтры перед употреблением стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Чтобы предупредить скручивание фильтров, их сначала помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50-60° С, и кипятят на слабом огне 30 мин, 2-3 раза меняя воду. Держатель и приемник фильтра стерилизуют заранее, прибор монтируют в асептических условиях. Чтобы не порвать мембранный фильтр о металлическую сетку, под него кладут кружки стерильной фильтровальной бумаги. Затем стерильным пинцетом с гладкими кончиками берут мембранный фильтр из стерилизатора и помещают на опорную сетку блестящей поверхностью вниз.

Простерилизованные в автоклаве свечи (Шамберлана) соединяют посредством резиновой трубки с приёмником и опускают в сосуд (чаще цилиндр) с фильтруемой жидкостью. Фильтрация происходит при помощи вакуумного насоса. В приемник поступает стерильный фильтрат, а бактерии задерживаются порами свечи.

Мембранные и асбестовые фильтры рассчитаны на одноразовое использование. Свечи после употребления кипятят в водопроводной воде, затем прокаливают в муфельной печи.

Перед последующим употреблением свечи проверяют на целостность. Свечу опускают в сосуд с водой и пропускают воздух. Если на поверхности свечи выступают пузырьки воздуха, значит в свече образовались трещины и она непригодна.

Контрольные вопросы

1. В чем заключается метод стерилизации фильтрованием? Что стерилизуют этим методом?

2. Какие бактериальные фильтры Вы знаете? Как монтируют прибор для фильтрования, какие условия необходимо соблюдать?

Химические способы

Этот вид стерилизации применяют ограниченно, и он служит в основном для предупреждения бактериального загрязнения питательных сред и иммунобиологических препаратов (вакцин и сывороток).

К питательным средам чаще всего прибавляют такие вещества, как хлороформ, толуол, эфир. При необходимости освободить среду от этих консервантов ее нагревают на водяной бане при 56° С (консерванты испаряются).

Для консервирования вакцин, сывороток пользуются мертиолатом, борной кислотой, формалином и т. д.

Биологическая стерилизация

Биологическая стерилизация основана на применении антибиотиков. Этот метод используют при культивировании вирусов.

Контрольные вопросы

1. Что такое химическая стерилизация и когда ее используют?

2. Что такое биологическая стерилизация?

Основные способы стерилизации представлены в табл. 4.

Таблица 4. Основные способы стерилизации

¹ (Стерилизация неполная: в стерилизуемом материале сохраняются споры.)

² (Стерилизация неполная: в стерилизуемом материале сохраняются вирусы.)

Дезинфекция

В микробиологической практике применяют различные дезинфицирующие вещества: 3-5% растворы фенола, 5-10% растворы лизола, 1-5% растворы хлорамина, 3-6% растворы перекиси водорода, 1-5% растворы формалина, растворы сулемы в разведении 1:1000 (0,1%), 70° спирт и др.

Дезинфекции подвергают отработанный патологический материал (гной, кал, моча, мокрота, кровь, спинномозговая жидкость) перед сливом его в канализацию. Обеззараживание проводят сухой хлорной известью или 3-5% раствором хлорамина.

Загрязненные патологическим материалом или культурами микроорганизмов пипетки (градуированные и пастеровские), стеклянные шпатели, предметные и покровные стекла опускают на сутки в стеклянные банки с 3% раствором фенола или перекиси водорода.

По окончании работы с заразным материалом лаборант должен обработать дезинфицирующим раствором рабочее место и руки. Поверхность рабочего стола протирают кусочком ваты, смоченным 3% раствором фенола. Руки дезинфицируют 1% раствором хлорамина. Для этого ватный шарик или марлевую салфетку смачивают дезинфицирующим раствором и протирают левую кисть, потом правую, а затем моют руки теплой водой с мылом.

Выбор дезинфицирующего вещества, его концентрация и длительность воздействия (экспозиция) зависят от биологических свойств микроба и от той среды, в которой будет происходить контакт дезинфицирующего вещества с патогенными микроорганизмами. Например, сулема, фенол, спирты непригодны для обеззараживания белковых субстратов (гной, кровь, мокрота), так как под их влиянием происходит свертывание белков, а свернувшийся белок предохраняет микроорганизмы от воздействия дезинфицирующих веществ.

При дезинфекции материала, инфицированного споровыми формами микроорганизмов, применяют 5% раствор хлорамина, 1-2,5% растворы активированного хлорамина, 5-10% растворы формалина и другие вещества.

Дезинфекцию, которую проводят на протяжении всего дня по ходу работы, называют текущей, а по окончании работы - заключительной.

Дезинфицирующие вещества и прописи приготовления из них рабочих растворов. Хлорная известь - белый комковатый порошок с резким запахом хлора, в воде растворяется не полностью. Бактерицидный эффект зависит от содержания активного хлора, количество которого колеблется от 28 до 36%. Хлорная известь, содержащая менее 25% активного хлора, для дезинфекции непригодна.

При неправильном хранении хлорная известь разлагается и теряет часть активного хлора. Разложению способствуют тепло, влага, солнечный свет, поэтому хранить хлорную известь следует в сухом, темном месте, в плотно закрытой таре.

Сухую хлорную известь применяют для обеззараживания выделений человека и животных (из расчета 200 г на 1 л испражнений и 10 г на 1 л мочи).

Приготовление исходного 10% осветленного раствора хлорной извести. Берут 1 кг сухой хлорной извести, помещают в эмалированное ведро и измельчают. Затем заливают холодной водой до объема 10 л, хорошо перемешивают, закрывают крышкой и оставляют на сутки в прохладном месте. После этого образовавшийся 10% осветленный раствор осторожно сливают и отфильтровывают через несколько слоев марли или процеживают через плотную ткань. Хранят в бутылях из темного стекла, закрытых деревянной пробкой, в прохладном месте, не более 10 сут. Рабочие растворы необходимой концентрации готовят из основного раствора непосредственного перед их употреблением. Количество основного раствора, необходимое для приготовления 0,2-10% осветленных растворов хлорной извести, приведено в табл. 5.

Таблица 5. Схема приготовления растворов хлорной извести

Концентрацию осветленных растворов хлорной извести от 0,2 до 10% выбирают в зависимости от характера обеззараживаемого объекта и устойчивости возбудителя.

Хлорамин - кристаллическое вещество белого или желтоватого цвета, содержит 24-28% активного хлора. Хорошо растворяется в воде при комнатной температуре, поэтому растворы его готовят непосредственно перед дезинфекцией. Пользуются 0,2-10% растворами хлорамина. Соотношение между процентной концентрацией раствора и количеством хлорамина в граммах на 1 и 10 л приведено в табл. 6.

Таблица 6. Схема приготовления различных растворов хлорамина

Растворяют хлорамин в стеклянной или эмалированной посуде. При хранении растворов хлорамина в посуде из темного стекла с притертой пробкой их активность сохраняется до 15 сут.

Активированный хлорамин. Дезинфицирующие свойства хлорамина усиливаются при добавлении к нему активатора в соотношении 1:1 или 1:2. В качестве активатора используют аммонийные соединения - хлорид, сульфат, нитрат аммония. Применяется активированный хлорамин в концентрации 0,5, 1 и 2,5%. Готовят их непосредственно перед употреблением. Раздельно отвешивают хлорамин и соль аммония. Сначала растворяют в воде хлорамин, а затем прибавляют активатор.

Преимущество активированных растворов хлорамина перед обычными заключается в том, что при добавлении активатора ускоряется выделение активного хлора. Поэтому препарат губительно действует не только на вегетативные формы микроорганизмов, но и на их споры. Активированный хлорамин применяют в более низких концентрациях и при меньшей экспозиции.

Фенол (карболовая кислота) представляет собой бесцветные кристаллы игольчатой формы с резким характерным запахом. Под действием света, воздуха и влаги кристаллы приобретают малиново-красный цвет. Хранят в закрытых банках из темного стекла и в защищенном от света месте.

Фенол растворим в воде, спирте, эфире, жирных маслах. Обладая большой гигроскопичностью, поглощает из окружающей среды влагу и становится жидким. Жидкая карболовая кислота содержит 90% кристаллического фенола и 10% воды.

Применяют 3-5% водные растворы карболовой кислоты, приготовленные из кристаллического фенола и жидкой карболовой кислоты по схеме, приведенной в табл. 7. Активность фенола повышается при растворении его в горячей воде (40-50° С).

Таблица 7. Схема приготовления различных растворов карболовой кислоты

Внимание! Кристаллический фенол или жидкая карболовая кислота, попадая на кожу, могут вызвать ее раздражение, а в больших концентрациях - тяжелые ожоги. Поэтому обращаться с карболовой кислотой нужно с большой осторожностью. При изготовлении растворов следует надевать резиновые перчатки или в крайнем случае смазать руки вазелином.

В случае попадания карболовой кислоты на кожу необходимо немедленно смыть ее теплой водой с мылом или 40° этиловым спиртом.

Примечание. Для приготовления дезинфицирующих растворов фенола удобнее и безопаснее использовать жидкую карболовую кислоту.

Контрольные вопросы

1. Какие дезинфицирующие вещества применяют в микробиологической практике?

2. Опишите внешний вид и основные свойства хлорной извести, хлорамина, фенола.

3. Какие растворы дезинфицирующих веществ используют для обеззараживания материала, инфицированного споровыми формами микроорганизмов?

Задание

Приготовьте 2 л 5% рабочего раствора осветленной хлорной извести; 500 мл 3% раствора хлорамина, 300 мл 1% раствора активированного хлорамина.

Внимание! Прежде чем приступить к приготовлению растворов, сделайте расчеты.

Непременно начните свои поиски проституток с уникального ассортимента на веб-ресурсе http://prostitutki-lipetska.party, ведь вам наверняка хотелось бы удовлетворить свои соблазнительные желания с милыми индивидуалками.