Фиксация материала

Фиксацией называется обработка материала такой жидкостью (фиксатором), в которой живой объект умерщвляется мгновенно при наименьших изменениях прижизненной структуры его клеток. При этом нестойкие набухающие коллоиды переходят в более стойкие. Некоторые фиксаторы играют еще и роль протравы объекта, делая его более восприимчивым к краскам. Кроме того, благодаря фиксации объект уплотняется, становится более компактным, упругим, т. е. более пригодным для резки. В соответствии с этими требованиями подбираются и компоненты фиксирующих жидкостей.

Существует очень много фиксаторов. В зависимости от того, какие части растения, какого возраста и для какой цели фиксируются, применяются различные фиксаторы. Выбор фиксатора зависит также от того, каким красителем будет окрашиваться препарат.

Фиксаторы разделяют на несколько групп в зависимости от вещества, составляющего их основу. Наиболее употребительными являются следующие фиксаторы: спиртовые, где спирт применяется в чистом виде или в смеси с уксусной, хромовой кислотой, хлороформом; хромовые (хромовая кислота в соединении с уксусной кислотой, формалином и другими веществами); формалиновые (в чистом виде, а также в соединении с уксусной, хромовой кислотой, спиртом и т. д.).

Для того чтобы цель фиксации была достигнута и получен доброкачественный материал, нужно соблюдать ряд условий.

Фиксатор должен быть всегда свежим, т. е. сохранять свой первоначальный состав неизменным. Некоторые фиксаторы могут храниться годами, другие должны приготовляться перед самой фиксацией ввиду их нестойкости. Не следует употреблять слишком крепкие фиксаторы, предпочтительнее использовать более слабые концентрации фиксаторов, выдерживая в них материал в течение несколько более длительного времени. Надо, чтобы фиксирующая жидкость всегда была в избытке для равномерности ее действия и предотвращения сильного разбавления соками фиксируемого растения. Фиксатор не должен быть теплым.

Фиксируемый материал должен быть разделен на небольшие кусочки в целях скорейшего пропитывания его фиксатором. Надо следить, чтобы из фиксируемого объекта был удален весь воздух. В некоторых случаях он нацело вытесняется фиксатором (лучшими в этом отношении являются спиртовые, худшими - водные), в других его приходится удалять искусственно, путем откачивания водоструйным насосом. Свободный от воздуха материал опускается на дно сосуда с фиксирующей жидкостью.

Надо следить, чтобы фиксируемый объект всегда был свежим, чтобы в нем не было признаков подсыхания или увядания, когда структуры его уже нарушены. Для этого следует производить фиксацию на месте произрастания растений или же сажать (или сеять) растения с целью получения из них материала для фиксации в горшки или сосуды, которые можно переносить в лабораторию. Нельзя использовать заранее сорванные растения.

Неправильность, допущенная при фиксации, сводит на нет все последующие операции, так как объект будет испорчен с самого начала.

В связи с тем что при любом исследовании фиксация не ограничивается одним образцом, следует соблюдать точное этикетирование фиксируемого материала и ведение ведомости. С этой целью в пробирку, банку или пузырек с фиксирующей жидкостью одновременно с погружением в нее образца следует положить этикетку с написанным на ней (только простым карандашом) порядковым номером: расшифровка этого номера делается в ведомости.

Помимо названия объекта, в ведомости нужно отразить дату фиксации, условия фиксации и т. д. В некоторых случаях обозначение объекта и условий фиксации пишут прямо на этикетке, но это менее удобно, так как она получается очень громоздкой.

Ведомость для фиксации имеет примерно следующий вид:

Одним из наиболее распространенных фиксаторов, применяемых к растительным объектам, является фиксатор Навашина, который представляет собой смесь ледяной уксусной кислоты, формалина и хромовой кислоты. Такой состав обеспечивает быстрое проникновение фиксатора в ткани, консервирование, уплотнение и протраву материала. В то же время он не вызывает сильного сжатия клеток. Этот фиксатор применяется в виде крепкого и слабого раствора. Первый наиболее распространен и особенно хорош для фиксации ядра и хромосом. Он имеет такой состав (по объему):

^* (Т. е. от того, который обычно в неразведенном виде имеется в лабораториях и является 40%-ным.)

^** (Слабый раствор фиксатора Навашина имеет несколько модификаций и содержит более слабые концентрации уксусной кислоты, формалина, а иногда и хромовой кислоты.)

При приготовлении фиксатора Навашина уксусную и хромовую кислоты можно слить вместе заранее, формалин же следует добавлять непосредственно перед фиксацией, иначе фиксатор будет разлагаться.

Срок пребывания объекта в фиксаторе Навашина составляет 12-24 ч.

Помимо описанного фиксатора, очень распространенным является фиксатор Карнуа. Он обладает способностью быстро проникать в ткани объекта и потому особенно удобен для фиксации объемистого эмбриологического материала (бутоны, завязи, семяпочки, части семени, пыльники). Отрицательным свойством фиксатора Карнуа является то, что он вызывает (вследствие быстрого проникновения) неравномерное сжатие тканей. Соответственно более коротким является и срок пребывания в нем объекта (6-12 ч).

Фиксатор Карнуа имеет такой состав (по объему):

Для изучения приемов фиксации (а в дальнейшем и всех операций, ведущих к получению постоянного цитологического препарата) лучше пользоваться молодыми корешками (их кончиками), полученными из проросших семян или тронувшихся в рост луковиц. Для этого луковицы ставят в банки с водой, а семена помещают во влажную среду на фильтровальную бумагу в чашку Петри или другой сосуд или же высевают в горшки с влажными опилками, песком или рыхлой землей^*.

^* (Если необходимо получить корешки не из пророщенных семян, а от развившегося уже растения, следует посадить такое растение в небольшой цветочный горшок и использовать те корешки, которые выйдут на поверхности кома земли и окажутся открытыми при вытряхивании кома из горшка.)

Корешки являются наиболее удобным объектом не только потому, что их легче всего получить в любое время года, но также и потому, что на них легче всего усвоить тонкую методику фиксации и дальнейшего изготовления препарата. Кроме того, препараты, приготовленные из кончиков корешков, служат прекрасным объектом для изучения строения покоящегося и делящегося ядра, картин его деления, а также особенностей цитоплазмы.

Фиксация корешков производится обычно в фиксаторе Навашина, который дает лучшие результаты для исследования тонких структур ядра и цитоплазмы.

При осуществлении фиксации кончики молодых корешков длиной около 1 см срезают маленькими ножницами или отщипывают тонким пинцетом и быстро стряхивают в пробирку или в небольшой пузырек с. широким горлом, заполненный фиксирующей жидкостью. Зафиксированный материал помещают в темное место и оставляют до следующего дня с расчетом, чтобы он находился там в течение 12-24 часов. После этого его подвергают промывке в воде и обезвоживанию.

В случае фиксации в жидкости Карнуа (которая обеспечивает лучшее удаление воздуха, более быстрое проникновение фиксатора и не требует последующего обезвоживания материала) цитологические картины получаются менее отчетливые, однако пригодные для наблюдения.

Следует иметь в виду, что для выявления митохондрий фиксаторы Навашина и Карнуа непригодны, так как входящая в их состав уксусная кислота разрушает эти нежные структуры. В этом случае пользуются фиксаторами Левицкого или Рего.

Существуют два фиксатора Левицкого - слабый и крепкий. Любой из этих фиксаторов состоит из двух фиксирующих смесей (I и II), в которых материал последовательно выдерживается.

Слабый фиксатор Левицкого имеет такой состав (по объему):

Крепкий фиксатор Левицкого отличается от слабого составом второй смеси и временем пребывания в ней материала.

После фиксации в фиксаторах Левицкого объект нужно промывать в проточной воде в течение суток.

Фиксатор Рего имеет следующий состав:

Следует ежедневно заменять старую фиксирующую жидкость свежей и проводить фиксацию в темном месте. Затем в течение 3-8 дней нужно выдержать материал в 3%-ном растворе двухромовокислого калия и промыть в проточной воде в течение суток.

Для проведения фиксации необходимо иметь следующее:

Оборудование. Весы и разновесы; пинцеты; ножницы; мензурки; пробирки или пузырьки емкостью 30-50 мл с пробками; чашки Петри; стаканы; тетрадь для записи; бумага для этикеток; фильтровальная бумага; карандаши.

Реактивы. Хромовый ангидрид; ледяная уксусная кислота; продажный формалин; хлороформ; 96%-ный спирт; хромовая кислота; осмиевая кислота; двухромовокислый калий.

Материал для фиксации. Пророщенные семена ржи, пшеницы, гороха, фасоли и др.; луковицы лука с молодыми корешками.