Обезвоживание и заключение материала в парафин

Конечным этапом обработки зафиксированного материала, предназначенного для изготовления постоянных цитологических (или эмбриологических) препаратов, является его резка на микротоме, для чего он должен быть заключен в подходящую для этого плотную среду. В микротомной технике обычно применяются две среды - парафин и целлоидин. Наиболее распространенной и универсальной средой является парафин. Целлоидин используется значительно реже, обычно для очень твердых объектов.

Для заключения зафиксированного материала в парафин его нужно обезводить и поместить в растворитель парафина. Обычно в качестве таких растворителей употребляют ксилол, толуол, бензол или хлороформ. Заключение в парафин проводят в 3 этапа:

1) обезвоживание материала, которое осуществляется путем постепенной замены воды спиртом;

2) помещение материала в растворитель парафина путем постепенной замены спирта растворителем парафина;

3) заключение материала в парафин, которое производится путем замещения растворителя парафина парафином (при температуре, обеспечивающей плавление парафина и улетучивание растворителя).

Процесс обезвоживания и помещения фиксированного материала в растворитель парафина и парафин называется проводкой. Сложность процесса проводки состоит в том, что перемещение материала из одной среды в другую должно происходить постепенно, без резкой смены ее состава и концентрации. В противном случае может быть нарушена структура клеток и тканей фиксированного материала. Чтобы постепенно перевести материал из воды в парафин, составляют набор смесей воды со спиртом (начиная со слабых концентраций и кончая 100%-ным спиртом) для обезвоживания объекта и набор смесей спирта с растворителем парафина со все возрастающим количеством (до 100%-ного) растворителя парафина для удаления спирта. Таким образом приготавливают "батарею" склянок или банок для проводки фиксированного материала.

Ниже мы приводим таблицу для приготовления смесей, употребляемых при проводке материала, с указанием длительности пребывания его в каждой жидкости. Сроки эти указаны применительно к корешкам и тому подобным мелким и нежным объектам. Для более крупных и грубых объектов сроки надо увеличивать.

Приготовление смесей для обезвоживания и удаления спирта

При составлении смесей спиртов обычно употребляют 96%-ный спирт. Если его разводить, точно придерживаясь заданных концентраций, то нужно делать пересчет на 100%-ный спирт. Для этого-в большинстве руководств по микротехнике даются таблицы. В том случае, если расчет процентного содержания спирта в смеси делать, принимая 96%-ный спирт за 100%-ный, концентрация всех растворов будет несколько ниже (на 1-3%). Но так как нас больше интересует не точная концентрация спирта в каждой смеси, а постепенность перехода, то вполне можно придерживаться последнего, более простого способа составления растворов.

В таблице на стр. 49 мы даем в первой графе концентрацию спирта в смесях в процентах, вычисленную от 96-%ного, условно принимаемого за 100%-ный, в скобках указывая истинное процентное содержание спирта. В третьей и четвертой графах мы даем количество спирта и воды на 100 мл смеси. Цифры в скобках обозначают количество жидкости, нужное для составления раствора, в процентах к 100%-ному спирту.

Для смесей с растворителем парафина следует употреблять только абсолютный (100%-ный) спирт.

Абсолютный спирт приготовляют из 96%-ного спирта путем добавления в него обезвоженного медного купороса (имеющего вид белого порошка). Этот реактив или имеется в готовом виде, или его надо получить путем прокаливания обводненного медного купороса (синие кристаллы). Прокаливание производят в фарфоровой чашке на слабом огне горелки при постоянном помешивании. После прокаливания купорос надо остудить и поместить в спирт или в хорошо закрывающуюся банку.

Для приготовления абсолютного спирта берут 200 г безводного купороса на литр 96%-ного спирта. Купорос насыпают непосредственно в банку со спиртом или, во избежание образования мути, перед этим плотно заворачивают в фильтровальную бумагу. Для получения спирта большей крепости его надо провести не менее чем через две порции купороса и держать в каждой не меньше суток.

Для осуществления проводки смеси наливают (или все время там содержат) в широкогорлые банки или небольшие кристаллизаторы с плотно закрывающими их пробками или крышками (имея в виду сильную испаряемость спирта и растворителей парафина).

По окончании промывки цилиндрики с зафиксированным материалом вынимают из воды и по возможности полностью стряхивают с них воду. С одного конца каждого цилиндрика снимают марлевую крышечку; другим же концом с надетой на него марлей цилиндрик ставят в банку с первой смесью; по истечении положенного времени цилиндрики переносят в следующую смесь^*.

^* (Если имеется небольшое количество образцов фиксированного материала, то можно поместить его после промывки в те же пробирки или пузырьки, которые употреблялись для фиксации, и последовательно наливать и сливать смеси. Это может быть удобным для проводки после фиксации в жидкости Карнуа, когда промывка спиртом легко может быть проведена без цилиндриков.)

При перенесении материала из одной жидкости в другую надо следить, чтобы он не находился долго на воздухе и не подсыхал, отчего может нарушиться структура.

Если всю проводку нет возможности провести за один день, то можно оставлять материал на ночь в 70-90%-ном спирте.

Можно, но менее желательно (от этого материал делается очень хрупким) оставлять его на ночь в растворителе парафина.

Из второй порции растворителя парафина (ксилол II) материал надо поместить в парафин. При замене растворителя парафина парафином также надо соблюдать постепенность. Для этого парафин вводят так, чтобы он постепенно растворялся и вытеснял растворитель.

По истечении срока пребывания материала во второй порции растворителя цилиндрики по очереди вынимают из него; каждый цилиндрик ставят в тигелек или фарфоровую чашечку с налитым в нее чистым растворителем; внутри тигелька (чтобы материал не подсох) снимают с цилиндрика марлевое донышко и счищают с него материал. После этого цилиндрик и марлю вынимают, а к растворителю добавляют накрошенный парафин^*. Тигелек закрывают крышкой и помещают в термостат, установленный на 56° С (температура плавления парафина), на сутки.

^* (Иногда, чтобы растворитель медленнее испарялся, содержимое тигелька заливают сверху парафином, после застывания которого образуется "пробка".)

Когда расплавившийся парафин хорошо пропитает объект, крышки с тигельков снимают и держат материал в термостате до тех пор, пока не испарится дочиста растворитель; обычно на это требуется 2-4 суток. Если удаление растворителя задерживается, то можно осторожно слить парафин, в котором находится материал, и заменить его свежим. Свободный от растворителя парафин с материалом разливают в заранее приготовленные небольшие плоские коробочки, размером примерно 3 X 2 X 1 см, из пергамента или плотной бумаги (рис. 22). Материал равномерно распределяют иголкой по дну коробочки. Этикетку, которая во время всей проводки перемещалась вместе с материалом, укладывают поверх застывающего парафина в углу плиточки с материалом.

Рис. 22. Изготовление коробочек для выливания парафинированного материала

Когда плиточки с материалом остынут, их вынимают из коробочек и в таком виде хранят до подготовки парафинированного материала для резки.

Для проведения проводки необходимо иметь следующее:

Оборудование. Термостат; большой сосуд для погружения цилиндриков; цилиндрики высотой 4-5 см, диаметром 1-2 см; марля и нитки для обвязывания цилиндриков; банки емкостью 200-300 мл с пробками для проводки от воды до парафина - 17 штук (по числу жидкостей в проводке), снабженные этикетками с обозначением жидкостей; тигельки высотой 2-3 см и средним диаметром 2-3 см, с крышками для заливки в парафин; бумажные коробочки для заливания парафинированного материала; ножницы; пинцет; карандаши; бумага.

Реактивы. Спирт 96%-ный: 1) для составления 10 смесей от 10 до 96%-ного для обезвоживания (по 100 мл) - 550 мл; 2) для приготовления двух порций 100%-ного спирта по 100 мл каждая - 400 мл; 3) для составления трех порций смеси абсолютного спирта с растворителем (всего 150 мл абс. спирта) - 300 мл. Всего 1250 мл.

Растворитель парафина - ксилол, бензол, толуол или хлороформ: I) для составления трех порций смеси со спиртом (всего 150 мл) и приготовления двух смен чистого растворителя (по 100 мл) -350 мл; 2) для заливки в парафин- 150-200 мл (на 100 образцов). Всего 500 мл.

Парафин 100-200 г на 20 образцов.