Нитропруссидная реакция

Нитропруссидная реакция служит для обнаружения аминокислот, белков и других соединений, содержащих - SH-группы. Для подобных соединений характерна высокая окислительно- восстановительная способность.

В зависимости от реакционной способности - SH-группы можно разделить на 3 категории:

1) высокореактивные свободные - SH-группы, свойственные аминокислотам и белкам; 2) "вялые" - SH-группы, связанные с белком; 3) маскированные (фиксированные), расположенные глубоко в белковой молекуле. Выявляются они после разрушения молекулы белка при помощи денатурирования кипячением или кислотами.

Нитропруссидная реакция позволяет открывать только свободные и фиксированные - SH-группы. Механизм реакции не расшифрован.

Реактивы

1) 5%-ный свежеприготовленный раствор нитропруссида натрия (в темной посуде).

2) Насыщенный спиртовой раствор уксуснокислого цинка.

3) 5%-ная и 15%-ная трихлоруксусная кислота.

Проведение реакции

1. Поместить срез на несколько минут в насыщенный спиртовой раствор уксуснокислого цинка в часовое стекло.

2. Оттянуть избыток реактива и обработать свежеприготовленным 5%-ным водным раствором нитропруссида натрия.

3. Наблюдать появление розовой окраски, указывающей на присутствие высокоактивных сульфгидрильных групп как свободных аминокислот, так и связанных с белком.

Чтобы определить, какое из этих веществ определяет появление окраски, нужно отмыть свободные аминокислоты и еще раз проделать реакцию. Сравнение интенсивности полученной окраски с окраской срезов, обработанных реактивами без отмывки аминокислот, позволяет судить о наличии или отсутствии свободных - SH-групп аминокислот и белков.

Для выявления фиксированных групп следует предварительно разрушить молекулу белка кислотой (при этом свободные аминокислоты вымываются) и проделать нитропруссидную реакцию.

Удаление свободных аминокислот

1. Обработать срезы 5%-ной трихлоруксусной кислотой в часовом стекле в течение 10-15 мин.

2. Промыть срезы водой.

3. Проделать нитропруссидную реакцию.

Появление розовой окраски указывает на присутствие свободных - SH-групп белка.

Выявление фиксированных (маскированных) - SH-групп белка

1. Обработать срезы 15%-ной трихлоруксусной кислотой в часовом стекле 3 раза по 5 мин.

2. Проделать нитропруссидную реакцию.

Появление более интенсивной розовой окраски по сравнению с. реакцией на свободные -SH-группы белка указывает на наличие фиксированных - SH-групп белка.

Результаты реакции (табл. 15, 16)

Таблица 15. Нитропруссидная реакция. Лист капусты. 1 - эпидермис; 2 - паренхима листа; 3 - колленхима пучка; 4 - ксилема; 6 - флоэма (увеличение 7 X 8)

В листе капусты мало свободных -SH-групп белков и аминокислот. Почти не окрашены паренхима и колленхима. Несколько ярче окрашены камбий и флоэма пучка. Количество фиксированных - SH-групп белков также незначительно. Слабое проявление нитропруссидной реакции в листе капусты объясняется сравнительно низким уровнем протекающих в нем жизненных процессов.

Таблица 16. Нитропруссидная реакция. Зерновка кукурузы. А - общий вид зерновки кукурузы в разрезе; Б - детали строения зерновки кукурузы; 1 - зародышевый корешок; 2 - щиток; 3 - всасывающий эпителий; 4 - алейроновый слой и прилегающие клетки эндосперма; 5 - алейроновый слой в нижней части зерновки; 6 - эндосперм около средней части щитка; 7 - эндосперм из центральной части зерновки; 8 - колеоптиле; 9 - точка роста почечки; 10 - проводящие пучки; 11 - колеориза (увеличение 7 X 8 и 7 X 40)

В зерновке кукурузы обнаруживаются свободные и фиксированные - SH-группы аминокислот и белков. В эндосперме окраска очень бледная, она заметна лишь в алейроновом слое. В зародыше реакция протекает очень интенсивно, особенно в почечке, корешке и колеоризе. Заметно выделяется также и эпителий щитка. Богатство зародыша - SH-группами указывает на интенсивность происходящих в нем окислительно-восстановительных процессов.