Глава 10. Некоторые вопросы направленной изменчивости риккетсий

Способность микроорганизмов приобретать устойчивость к вредным для них веществам впервые отметил в 1887 г. М. Г. Косяков, показав, что при добавлении в питательную среду возрастающих количеств борной кислоты, сулемы и буры, губительно действующих на бациллы сибирской язвы и сенную палочку, последние приобретают способность расти и размножаться в присутствии данных агентов. Этими исследованиями фактически было положено начало учению о лекарственной устойчивости микроорганизмов.

К настоящему времени накопилось большое количество данных, свидетельствующих о том, что различные микроорганизмы способны повышать устойчивость к действию химиотерапевтических веществ и антибиотиков (П. Н. Голяков, Ю. Е. Конев, 1959; П. Н. Кашкин, 1960, и др.). Что же касается риккетсий, то, несмотря на длительный период успешного применения антибиотиков при лечении риккетсиозов, в литературе отсутствуют данные об образовании в естественных условиях лекарственноустойчивых штаммов риккетсий. Это обстоятельство дало основание К. М. Лобану (1960) считать, что у риккетсий не вырабатывается устойчивости к антибиотикам, в частности к левомицетину и тетрациклину. Stoker на Пагоушской конференции в 1959 г. заявил, что до сих пор неизвестны штаммы риккетсий, устойчивые к лекарственным веществам.

Однако едва ли правильно считать, что риккетсии не способны к образованию лекарственноустойчивых форм, которые фактически являются частным проявлением изменчивости микроорганизмов.

Ряд авторов отмечает, что образование резистентных форм микроорганизмов происходит в том случае, если эти микроорганизмы чувствительны к применяемому антибиотику и обладают самостоятельным метаболизмом, на определенные звенья которого и воздействует антибиотик, изменяя свойства возбудителя (Н. А. Красильников, 1959; М. Н. Лебедева, С. Д. Воропаева, 1960; В. Д. Тимаков, А. Г. Скавронская, 1956). Поэтому при оценке возможности образования антибиотикоустойчивых форм риккетсий необходимо учитывать наличие у них самостоятельного метаболизма и собственных энзимов, а также механизм действия антибиотиков.

Ранее уже была показана способность риккетсий к самостоятельному энергетическому и пластическому обмену, наличие - у них весьма сложной ферментативной системы и чувствительности к большому числу химиотерапевтических препаратов и антибиотиков. Следовательно, уже априорно можно считать, что существуют все предпосылки для образования штаммов риккетсий, устойчивых к антибиотикам.

Исходя из общебиологических закономерностей, нельзя не признать за риккетсиями способности к изменению наследственных свойств под влиянием внешних факторов, к которым относятся и лекарственные вещества. Убедительным подтверждением правомерности этого положения являются результаты исследований, проведенных Weiss с сотрудниками (1957, 1959, 1960, 1962), по изучению условий адаптации штамма E риккетсий Провачека к парааминобензойной кислоте (ПАБК) и к 2 - 3-диметилквиноксалин - 1 - 4-диоксиду. В результате серии пассажей на куриных эмбрионах в присутствии возрастающих доз указанных веществ были получены культуры риккетсий с повышенной устойчивостью. Так, после 3 пассажей в присутствии ПАБК устойчивость риккетсий к этому препарату возросла в 6 раз, а после 14 - 16 пассажей - в 20 раз. Резистентность к квиноксалин - оксиду после 20 пассажей повысилась в 5 раз. Размножение варианта риккетсий, адаптированного к ПАБК, подавлялось добавлением квиноксалин - оксида, и, наоборот, вариант, более устойчивый к этому препарату, подавлялся ПАБК - При пассировании смеси двух полученных вариантов риккетсий на куриных эмбрионах с добавлением высоких концентраций ПАБК и квиноксалиноксида был получен вариант, устойчивый к обоим препаратам. Свойства риккетсий, не связанные с устойчивостью к лекарственным веществам, оставались неизмененными у подавляющего большинства полученных штаммов. Однако варианты, адаптированные к квиноксалин - оксиду, несколько снизили вирулентность для куриных эмбрионов и хлопковых крыс. Квиноксалиноустойчивы и вариант возбудителя, как правило, не вызывал гибели куриных эмбрионов, хотя в мазках из желточных оболочек обнаруживалось большое количество риккетсий. Одновременно со снижением инфекционности для куриных эмбрионов наблюдалось изменение вирулентности для хлопковых крыс вплоть до ее утраты. Первоначально изменение вирулентности было незначительным, но последующие субкультуры полностью утратили вирулентность, в результате чего хлопковые крысы не погибали даже при введении им очень больших доз возбудителя, а иммунитет вызывался лишь при инокуляции значительного количества риккетсий. Токсичность культур для белых мышей не менялась. Вирулентность лекарственноустойчивых вариантов для куриных эмбрионов наиболее показательно выражается отношением значений инфицирующей дозы (ID₅₀) к летальной дозе (LD₅₀) культуры. Высокие величины этих отношений характеризуют низкую вирулентность и наоборот. В табл. 22 приведены отношения для полученных Weiss различных вариантов штамма E риккетсий Провачека.

Полученные Weiss результаты наглядно показывают, что устойчивые к квиноксалин-оксиду варианты менее вирулентны, чем чувствительные к этому препарату субштаммы. Весьма интересные наблюдения отмечены в опытах, когда вариантам, устойчивым к ПАБК или эритромицину, в течение 1 - 2 субпассажей наводили резистентность и к квиноксалин-оксиду. В этом случае появление устойчивости к квиноксалин-оксиду ассоциировалось с потерей вирулентности для куриных эмбрионов. Вместе с тем у устойчивых к лекарственным веществам вариантов не наблюдалось изменения токсичности для белых мышей, гемолитической активности к кроличьим эритроцитам и уровня выработки комплементсвязывающих антител у зараженных морских свинок.

Полученные изменения свойств риккетсий Weiss относит к многоступенчатым мутациям, а образование устойчивого к двум препаратам варианта - к генетической рекомбинации, поскольку двух совместных пассажей культур, адаптированных к ПАБК и квиноксалин-оксиду, в результате которых получен этот вариант, оказалось недостаточно для адаптации к двум антибиотикам. Однако от окончательного вывода о механизме образования устойчивости Weiss воздержался.

Таблица 22. Вирулентность вариантов штамма E риккетсий Провачека для куриных эмбрионов (Weiss, 1960)

Наведенная резистентность риккетсий Провачека к ПАБК, по данным Weiss с соавторами (1959), может быть подавлена добавлением к культуре салициловом или ацетилсалициловой кислоты (АСК). Однако при проведении серии пассажей на куриных эмбрионах риккетсий Провачека, устойчивых к ПАБК, в присутствии АСК был получен вариант, устойчивый к АСК и сохранивший резистентность к ПАБК. Этот факт может рассматриваться как проявление последовательного наведения новых свойств риккетсиям. Вместе с тем значение указанных наблюдений состоит и в том, что они объясняют степень и природу лекарственной конкуренции и место приложения энзимных систем, связанных с утилизацией риккетсиями ПАБК и других лекарственных веществ.

В 1960 г. Weiss и Drossier опубликовали материалы, свидетельствующие о возможности адаптации штамма E риккетсий Провачека к эритромицину. Ранее исследованиями Ormsbee, Parker и Pickens (1955) было показано, что эритромицин в зависимости от дозировки обладает риккетсиостатическим или риккетсиоцидным действием. Указанное наблюдение давало основание к изучению условий образования эритромициноустойчивых форм риккетсий. С этой целью штамм E риккетсий Провачека, взятый в высоких концентрациях, был проведен в серии пассажей на куриных эмбрионах с добавлением возрастающих доз эритромицина (лактальбуминат эритромицина). В начале пассажей к культуре риккетсий добавляли субриккетсиостатическую дозу антибиотика, равную 12,5 у на яйцо. Первые изменения в резистентности риккетсии были отмечены после 3 пассажей. При последующих пассажах наблюдалось прогрессирующее повышение устойчивости риккетсий к эритромицину.

В результате такого воздействия устойчивость риккетсий Провачека к эритромицину была повышена более чем в 150 раз. После 10 пассажей на куриных эмбрионах без антиоиотика наведенная резистентность полностью сохранилась. Полученный вариант сохранял исходную чувствительность к ПАБК, хлорамфениколу и тетрациклину, но приобрел резистентность, правда, в несколько меньшей степени, к карбомицину и олеандомицину, т. е. антибиотикам группы макролидов, к которой относится и эритромицин. Проверка вирулентности антибиотикоустойчивого варианта риккетсий для куриных эмбрионов и хлопковых крыс показала его полную идентичность с исходным штаммом E риккетсий Провачека.

Причину образования эритромициноустойчивого варианта авторы рассматривают как одноступенчатую мутацию с частотой образования в разных пассажах резистентных форм в отношении 1:10^5,5-1:10³. Получение эритромициноустойчивого варианта, по мнению Weiss, свидетельствует о генетической лабильности риккетсий Провачека. Лабильность риккетсий подтверждается последующими исследованиями Weiss и результатами наблюдений Kassai (1958). Так, при лечении белых мышей, инфицированных риккетсиями лихорадки цуцугамуси (штамм Бокото), субтерапевтическими дозами хлортетрациклина, тетрациклина, виннокаменной кислой соли лейкомицина и хлорамфеникола, Kassai после 3 пассажей на белых мышах не отметил возрастания резистентности риккетсий к хлортетрациклину, но после 7 пассажей наблюдал повышение устойчивости риккетсий к этому антибиотику. Было установлено одновременное повышение резистентности и к тетрациклину при сохранении исходной чувствительности к хлорамфениколу и леикомицину. Наведенная резистентность сохранялась по крайней мере в течение 12 пассажей (срок наблюдения) без добавления антибиотика. Вирулентность полученных антибиотнкорезистентных культур не отличалась от вирулентности исходного штамма.

В 1962 г. Weiss и Dressier сообщили об адаптации штамма H риккетсий Провачека в куриных эмбрионах к хлорамфениколу и штамма Вильмингтон риккетсий Музера к квиноксалин-оксиду. В исследованиях с риккетсиями Музера в результате 14 пассажей с антибиотиком было получено 3 варианта, которые оказались абсолютно или почти абсолютно резистентными к квино-ксалин-оксиду2 причем их биологические свойства существенно не изменились; лишь у одного варианта несколько снизилась вирулентность для куриных эмбрионов.

Итак, в указанных исследованиях была продемонстрирована принципиальная возможность получения путем адаптации, а возможно, и рекомбинации, вариантов риккетсий Провачека, Музера и возбудителя лихорадки цуцугамуси, устойчивых к отдельным лекарственным веществам и их сочетаниям. Степень повышения резистентности к различным веществам у разных риккетсий оказалась неодинаковой. Так, при адаптации к эритромицину резистентность штамма E риккетсий Провачека после 11 - 12 пассажей повысилась в 70 - 160 раз. Устойчивость риккетсий Музера к квиноксалин - оксиду после 14 пассажей оказалась практически абсолютной, тогда как резистентность штамма E риккетсий Провачека к этому препарату повысилась лишь в 5 раз. Таким образом, можно четко проследить различия в индивидуальной чувствительности и изменчивости риккетсий и зависимость изменчивости от характера химиотерапевтического препарата.

Результаты приведенных исследований имеют не только теоретическое значение для решения вопроса об изменении наследственных свойств риккетсий под действием лекарственных веществ, но имеют важное практическое значение, поскольку свидетельствуют о возможности возникновения лекарственноустойчивых форм риккетсий в экспериментальных условиях. Это особенно наглядно проявилось в опытах Kassai (1958) при лечении белых мышей субтерапевтическими дозами антибиотиков. Эти наблюдения убедительно обосновывают необходимость правильного подхода к антибиотикотерапии при риккетсиозах во избежание образования лекарственноустойчивых форм риккетсий в организме больного в случае недостаточно продолжительного курса лечения или при применении небольших доз препаратов.

Наряду с повышением устойчивости к лекарственным веществам под их влиянием у микроорганизмов могут возникать своеобразные изменения, получившие название феномена L - трансформации. Как показали исследования с бактериями, позднее воспроизведенные в опытах с риккетсиями, L - формы микроорганизмов возникают при воздействии на них в процессе развития некоторых факторов, к числу которых относятся химиотерапевтические вещества, антибиотики, антисептики, аминокислоты и другие агенты. Впервые это явление было описано в 1894 г. Н. Ф. Гамалеей у бактерий брюшного тифа, у которых под влиянием солей лития наступали разнообразные изменения формы микробных клеток. Kliene - berger (1936) впервые показано своеобразие L - трансформации, заключающееся в сочетании морфологических изменений с изменчивостью культуральных и серологических свойств. Позже было установлено, что образование L - форм, как правило, сопровождается снижением или утратой вирулентности исходного штамма (В. Д. Тимаков, Г. Я. Каган и В. С. Левашев, 1958).

Изменение размеров и формы риккетсий, особенно риккетсий Бернета, под влиянием некоторых факторов внешней среды было отмечено многими исследователями и отнесено к патологическим, или инволюционным, формам изменчивости (П. Ф. Здродовский и Е. М. Голиневич, 1956; Lepine, 1932).

А. Т. Кравченко с соавторами (1961) при одновременном введении 100 ЕД/мл пенициллина с суспензией риккетсий Бернета в культуру клеток HeLa наблюдал образование в цитоплазме клеток микроколоний, содержащих, как правило, крупные формы риккетсий. Размеры риккетсий при этом широко варьировали и иногда в 10 раз превышали обычные размеры возбудителя. В то же время не все риккетсии изменяли размеры и форму. Несмотря на резкие морфологические изменения, риккетсии продолжали интенсивно размножаться в клетках HeLa, вызывая их гибель. В случае введения больших доз антибиотика (500 - 1000 ЕД/мл) размножение риккетсий в клетках прекращалось, однако после отмывания пенициллина рост возбудителя продолжался, вызывая отмирание и разрушение клеток. Кроме того, при удалении из питательной смеси антибиотика риккетсии принимали обычные размеры и форму.

Биологическая сущность изменения размера и формы риккетсий под влиянием пенициллина была установлена В. Я. Подоляном, О. С. Будимой и В. Н. Милютиным (1964) при изучении влияния пенициллина, метионина, фенилаланина, глицина, триптофана и пептона на характер роста и морфологию риккетсий Бернета в культуре клеток. Под действием пенициллина, пептона, метионина, фенилаланина и глицина происходило укрупнение риккетсий и изменение их формы (полиморфизм). При электронномикроскопическом изучении неизмененных риккетсий было отмечено преобладание риккетсий овальной формы, а на ультратонких срезах - наличие ярко выраженной наружной оболочки, ограничивающей светлый участок протоплазмы, в котором находились плотные гранулы различных размеров. Иная картина наблюдалась в культурах, где развитие риккетсий Бернета происходило в присутствии указанных веществ. В этом случае размеры риккетсий во много раз превышали нормальные, а внутренняя структура отличалась отсутствием четко разграниченной оболочки и протоплазмы и наличием плотных гранул. Изменения размера, формы и внутренней структуры риккетсий авторы оценили как проявление L - трансформации риккетсий Бернета по аналогии с подобным феноменом у бактерий.

Наши наблюдения за размножением вакцинного штамма E и вирулентных штаммов риккетсий Провачека в присутствии пенициллина (100 - 200 ЕД/мл), стрептомицина (100 - 200 ЕД/мл), террамицина (2 - 5 γ/мл), 1% пептона, 20 мг% глицина и 6 мг% метионина в развивающихся куриных эмбрионах или культуре ткани (клеточные штаммы HeLa, КВ, HEp - 2, amnion) свидетельствуют о том, что размер и форма риккетсий Провачека под влиянием указанных веществ не изменяются. Таким образом, у риккетсий Провачека в отличие от риккетсий Бернета не удалось отметить проявления феномена L - трансформации при добавлении к питательной среде некоторых антибиотиков и аминокислот как в момент инфицирования культуры клеток, так и во время обильного накопления риккетсий. Причина этого явления, вероятно, объясняется различным строением и химическим составом оболочки и вироплазмы риккетсий Бернета (преобладание полисахаридного компонента в составе оболочки) и риккетсий Провачека (преимущественно лигюйдный состав оболочки), а следовательно, и различным действием испытанных веществ. Показательно, что риккетсии Бернета значительно более устойчивы к действию антибиотиков, в том числе и пенициллина, что, по-видимому, объясняется их способностью к образованию L - форм как способа защиты от неблагоприятного воздействия некоторых факторов, тогда как риккетсии Провачека, лишенные возможности образовывать L - формы и тем самым приспосабливаться к неадекватным условиям существования, прекращают размножаться при добавлении к среде обитания значительно меньших концентраций антибиотика. Приспособительный характер L - трансформации риккетсий Бернета под влиянием некоторых веществ, несомненно, подтверждается и однотипными, неспецифическими проявлениями изменений, возникающих под влиянием весьма различных по природе и механизму действия веществ.

Для того чтобы составить представление о механизме и природе L - трансформации риккетсий Бернета, необходимо рассмотреть механизм действия пенициллина на бактериальную клетку, ибо выяснение этого явления позволит правильно понять и сущность проявления L - трансформации под действием пенициллина. Известно, что пенициллин действует только на размножающиеся бактериальные клетки, угнетая полимеразу и подавляя синтез полимеров, входящих в состав бактериальной стенки. Наряду с этим пенициллин подавляет синтез нуклеиновых кислот, а следовательно, и нормальную функцию генетического аппарата. Угнетение синтеза клеточной оболочки приводит к прекращению деления растущих клеток и образованию полиморфных, инволюционных форм микроорганизмов. У микробной клетки при этом исчезает оболочка, но сохраняется цитоплазматическая мембрана, в результате чего бактериальная клетка превращается в протопласт. При удалении пенициллина клетка возвращается в нормальное состояние (Ю. О. Сазыкин, 1961). Сходное явление наблюдается и в случае L - трансформации риккетсий Бернета.

Трактовать природу феномена L - трансформации риккетсий можно как форму обратимой, модификаиионной изменчивости под влиянием внешних, неблагоприятных для развития бактериальной клетки воздействий. Исключение влияния L - трансформирующего фактора на развитие риккетсий приводит к восстановлению исходных, свойств возбудителя. Таким образом, на примере воздействия на риккетсии химиотерапевтических веществ, в частности антибиотиков, удается проследить наличие двух фаз изменчивости: по-первых, наследственно закрепленной, необратимой - в процессе образования лекарственноустойчивых форм риккетсий и, во - вторых, модификационной, обратимой, что проявляется в феномене L - трансформации при временном воздействии некоторых агентов, в том числе и лекарственных веществ. В случае же постоянного воздействия или же введения больших доз этих веществ рост возбудителя прекращается.

В последние годы внимание исследователей привлекает особая форма изменчивости, возникающая в случае выращивания микроорганизмов в присутствии ДНК другого штамма или вида возбудителя. После широко известных опытов Griffith (1928) и Avery с соавторами (1944), послуживших основанием для всестороннего изучения этой проблемы, накопились убедительные данные о возможности наведения у микроорганизмов с помощью ДНК самых различных свойств: антигенности, вирулентности, антибиотикоустойчивости. Вместе с тем возможность трансформации риккетсий к настоящему времени остается малоизученной. Имеется всего лишь одно сообщение Price с соавторами (1958) о превращении риккетсий Провачека в риккетсии Музера с помощью ДНК из риккетсий Музера. В этих опытах очищенные риккетсии Музера, содержащие около 10^12,5 особей в 1 мл, были подвергнуты ультразвуковому воздействию в течение 20 минут с целью разрушения корпускул риккетсий. Для удаления и инактивации неразрушенных риккетсий озвученные экстракты центрифугировали в течение 10 минут при 1000 g, а супернатант прогревали 15 минут при 65° и затем очень быстро охлаждали до 4°. Полученный экстракт в количестве 0,5 мл смешивали с живыми риккетсиями Провачека, содержавшими 107 особей в 0,1 мл, и в общем объеме 0,6 мл вводили белым мышам в брюшную полость. Контрольным мышам вводили только озвученный экстракт риккетсий Музера или только живые риккетсии Провачека. Через 10 дней из мозга мышей готовили 10% суспензию на сахарозно-фосфатно-глютаминовом растворе (Bovarnick с соавторами, 1950) и по 0,05 мл вводили в мозг белым мышам. После 5 внутримозговых субпассажей заражали куриные эмбрионы 5% суспензией мозга каждой мыши. На 10-й день инкубации Зараженные яйца вскрывали и из желточных мешков готовили мазки, которые окрашивали по Маккиавелло. При обнаружении в мазках риккетсий из смеси 3 желточных мешков готовили 10% суспензию, которую вводили внутрибрюшинно по 0,25 мл хлопковым крысам. В случае отсутствия риккетсий в мазках производили 3 слепых субпассажа в куриных эмбрионах, а затем заражали хлопковых крыс, у которых через 28 дней брали кровь для выявления антител в реакции связывания комплемента с антигенами риккетсий Провачека и риккетсий Музера. Из 21 серии опытов пять были исключены, так как у контрольных мышей, обработанных только экстрактами риккетсий Музера, были выделены живые риккетсии Музера. В 13 сериях риккетсии не были выделены и лишь в 3 сериях была отмечена трансформация риккетсий Провачека в риккетсии Музера.

После изучения культуральных (заражением вшей и блох) и серологических свойств выделенные культуры риккетсий были идентифицированы как риккетсии Музера. Ни в одном случае после введения мышам только экстракта или только риккетсий Провачека не были обнаружены риккетсии Музера.

В контрольных опытах при добавлении к экстракту 5 γ трижды перекристаллизированной ДНК - азы при инкубации в течение 15 минут при 24° не произошло трансформации риккетсий Провачека в риккетсии Музера. Хотя только в 3 из 21 серии опытов были получены положительные результаты, Price считает вполне убедительным превращение риккетсий Провачека в риккетсии Музера в результате трансформирующего воздействия ДНК, содержащейся в экстракте из риккетсий Музера.

Исследования Price с. сотрудниками по трансформации риккетсий являются первым наблюдением относительно изменения наследуемых признаков риккетсий под влиянием ДНК. Кроме большого теоретического значения, эти исследования, вскрывающие генетические свойства риккетсий, имеют и практическую ценность, позволяя направленно изменять свойства риккетсий в требуемом для человека направлении, например для получения вакцинных штаммов.