Опыт 11.1. Изучение окисления одного из промежуточных продуктов цикла Кребса

Наиболее эффективный способ извлечения энергии из субстрата с запасанием ее для последующего использования состоит в расчленении этого процесса на ряд более простых обратимых реакций, катализируемых ферментами. Одна из таких промежуточных реакций - это окисление янтарной кислоты в фумаровую путем отщепления водорода.

Известны вещества, способные присоединять отщепленные водородные атомы и при этом изменять свой цвет. Одно из таких веществ - 2,6 - дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ); его окисленная форма окрашена в синий цвет, а восстановленная бесцветна.

Если окисленная форма ДХФИФ при смешивании с тканевым экстрактом обесцвечивается, то можно предположить, что причина этого - присоединение атомов водорода от янтарной кислоты. Добавим к смеси янтарную кислоту. Если теперь скорость обесцвечивания возрастает, то это подкрепит нашу гипотезу о том, что ДХФИФ играет роль акцептора атомов водорода, отщепляющихся от янтарной кислоты.

Поскольку большинство реакций в живых организмах катализируется ферментами, ясно, что окисление будет происходить лишь в том случае, если в среде имеется надлежащий фермент. Реакцию окисления янтарной кислоты катализирует фермент сукцинатдегидрогеназа, и дополнительные исследования позволяют выявить присутствие этого фермента. В нашем опыте источником фермента будет служить суспензия митохондрий из прорастающих семян маша (Phaseolus aureus). Важно выделять митохондрии как можно быстрее. После разрушения клеток метаболизм почти сразу же прекращается.

Опыт делится на две части: 1) выделение нужного фермента и 2) использование его для окисления янтарной кислоты. ДХФИФ служит индикатором, который позволяет определить, идет ли реакция или нет.

Все, что требуется для первой части опыта (т.е. для приготовления ферментного экстракта), желательно до начала работы не менее часа выдержать в холодильнике.

4 центрифужные пробирки (по 15 мл)

2 стеклянные палочки

2 градуированные пипетки на 10 мл

2 лабораторных стакана емкостью 1 л (желательно полиэтиленовые)

Лед

Соль

Семена маша

Пробирки со штативом 1 градуированная пипетка на 1 мл

Таймер

Растворы (указания относительно приготовления растворов даны после описания опыта):

Забуференный раствор сахарозы

Забуференный раствор сахарозы + раствор янтарной кислоты

0,1%-ный ДХФИФ (приготовляется на забуференном растворе сахарозы) Дистиллированная вода

1. Прорастите семена маша (24 шт.), поместив их на влажную вату и оставив в темноте на 3-4 дня.

2. Приготовьте ледяную баню: положите лед в полиэтиленовый стакан емкостью 1 л и добавьте к нему соли, чтобы понизить температуру.

3. Поместите в стакан со льдом забуференный раствор сахарозы и две центрифужные пробирки.

4. Удалите у 12 проросших семян оболочки и корешки.

5. Поместите в каждую центрифужную пробирку по шесть семян.

6. Добавьте в каждую пробирку по 1 мл забуференного раствора сахарозы, не содержащего янтарной кислоты.

7. Тщательно размельчите семена с помощью охлажденной стеклянной палочки; пробирки должны при этом все время оставаться в стакане со льдом.

8. Добавьте в каждую центрифужную пробирку еще по 10 мл забуференного раствора сахарозы.

9. Поместите центрифужные пробирки в центрифугу (друг против друга) и прокрутите их при максимальной скорости в течение 3 мин.

10. Верните центрифужные пробирки в стакан со льдом.

11. Внесите пипеткой в одну из лабораторных пробирок 15 мл дистиллированной воды и отметьте положение мениска.

12. Вылейте дистиллированную воду и заполните пробирку до отметки надосадочной жидкостью из центрифужных пробирок.

13. Следующее необходимо проделать очень быстро: добавьте в ту же лабораторную пробирку 0,5 мл раствора ДХФИФ и перемешайте содержимое, заткнув пробирку большим пальцем и перевернув ее.

14. Во время перемешивания растворов включите отсчет времени.

15. Отметьте цвет раствора через 20 мин.

16. Повторите весь эксперимент, использовав на этот раз забуференный раствор сахарозы, содержащий янтарную кислоту.

Проследить за ходом эксперимента можно и с

помощью колориметра.

1. Поставьте красный фильтр, включите колориметр и дайте ему прогреться в течение 5 мин.

2. Добавьте 0,5 мл раствора ДХФИФ к 15 мл надосадочной жидкости, как описано выше.

3. Смешайте растворы и включите отсчет времени.

4. Поместите пробирку в колориметр и установите прибор на 0% пропускания.

5. Снимите показания колориметра через 1, 2, 5, 10 и 20 мин.

6. Повторите тот же опыт, но с забуференным раствором сахарозы, содержащим янтарную кислоту.

7. Постройте график зависимости пропускания (ось ординат) от времени.

8. Сформулируйте выводы, которые можно сделать на основании полученных результатов.

Забуференный раствор сахарозы (100 мл)

 Гидрофосфат натрия (Na2HPO4)	0,76 г 
 Дигидрофосфат калия (КН2РО4)	0,18 г 
 Сахароза	                13,60 г 
 Сульфат магния	                0,10 г

Забуференный раствор сахарозы + янтарная кислота (100 мл)

 Забуференный раствор сахарозы, приготовленный, как описано выше, плюс: 
 Янтарная кислота               1,36 г 
 Гидрокарбонат натрия           1,68 г

Лучше всего сразу приготовить забуференный раствор сахарозы в количестве, достаточном для обеих частей опыта (раствор готовится на дистиллированной воде). После этого следует разделить раствор на две равные части и добавить к одной из них янтарную кислоту и гидрокарбонат натрия (в соответствующей концентрации).

Когда к забуференному раствору сахарозы добавляют янтарную кислоту и гидрокарбонат натрия, жидкость вскипает. Раствор следует хорошо встряхнуть, чтобы вся углекислота выделилась, так как ее присутствие может сказаться на результатах эксперимента.

Растворите 0,1 г дихлорфенолиндофенола в 10 мл забуференного раствора сахарозы (без янтарной кислоты для обеих частей эксперимента). Растворяется это вещество не слишком хорошо, поэтому после тщательного перемешивания суспензию следует профильтровать.