Реакция с метиловым зеленым - пиронином наРНК и ДНК

Эта реакция основана на базофилии нуклеиновых кислот, обусловленной наличием в них остатков фосфорной кислоты (=HPO₄). Большая часть основных красок окрашивает одинаково РНК и ДНК. В данной же реакции два основных красителя красят избирательно: метиловый зеленый имеет сродство к ДНК и окрашивает ее в зеленый цвет, пиронин - к РНК и окрашивает ее в красный цвет.

При окраске метиловым зеленым - пиронином клеточные ядра выглядят в некоторых случаях не зелеными, а голубыми или синими вследствие примешивающегося красного окрашивания содержащейся в ядре РНК. По удалении РНК из ядра плазма обесцветится, а ядра будут не синими, а зелеными.

Существует мнение, что интенсивность реакции на ДНК с метиловым зеленым зависит от количества имеющейся высокополимерной ДНК; РНК, будучи сравнительно низкополимерной, не окрашивается метиловым зеленым, как и низкополимерная ДНК.

Некоторые авторы считают, что избирательная окрашиваемость ДНК метиловым зеленым основана на стереохимических отношениях молекулы ДНК и молекулы метилового зеленого, так как расстояние между положительно заряженными группами в краске точно равно расстоянию между отрицательно заряженными частицами в ДНК.

Пиронин не является специфичным красителем на РНК, так как он может окрашивать также структуры, не содержащие РНК. Существует мнение, что пиронин может окрашивать и деполимеризованную ДНК.

Имея в виду недостаточную специфичность реакции с метиловым зеленым - пиронином для выявления РНК, следует сделать проверку по Браше, т. е. подействовать на препарат рибонуклеазой, которая разрушает РНК, и затем снова провести реакцию. Если после действия рибонуклеазой красная окраска ослабнет или исчезнет, а ядра из синих станут зелеными, значит, рибонуклеаза разрушила РНК.

Соответственно можно сделать проверку и на специфичность реакции на ДНК, подействовав дезоксирибонуклеазой - ферментом, разрушающим ДНК. Но это является менее необходимым, так как локализация ДНК более постоянна и определенна.

При подготовке объектов для исследования надо иметь в виду, что кислые фиксаторы могут нарушить стереохимическую картину, поэтому надо избегать длительной фиксации. Обычно применяют фиксатор Карнуа или спирт.

Реактивы

1) Раствор метилового зеленого - пиронина.

Приготовление раствора. Раствор А: 17,5 мл 5%-ного водного раствора пиронина и 10 мл 2%-ного водного раствора метилового зеленого растворить в 250 мл дистиллированной воды^*. Раствор Б (ацетатный буфер с pH=4,8): 1,2 мл ледяной уксусной кислоты влить в мерную колбу на 100 мл и разбавить водой до метки; 2,72 г уксуснокислого натрия растворить дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл и довести водой до метки; к 77 мл полученного раствора уксусной кислоты прилить 100 мл раствора уксуснокислого натрия. Перед употреблением слить растворы А и Б в равных объемах.

^* (Препараты метилового зеленого всегда загрязнены метиловым фиолетовым. Поэтому перед употреблением метиловый зеленый Должен быть очищен от примеси. Это достигается экстрагированием его хлороформом: к раствору метилового зеленого нужной концентрации, находящемуся в делительной воронке, добавляют равное количество хлороформа, тщательно взбалтывают, дают отстояться (1-2 дня) и сливают хлороформ. Так повторяют несколько раз, пока хлороформ не перестанет окрашиваться в фиолетовый цвет.)

2) 0,1-1%-ный раствор рибонуклеазы (или профильтрованной слюны).

3) Ацетон.

4) Ксилол.

5) Смеси ацетона с ксилолом в отношении 9:1; 5:5; 1:9.

6) Канадский бальзам.

Проведение реакции

1. Поместить препараты в дистиллированную воду.

2. Поместить часть препаратов^* в буферный метиловый зеленый - пиронин на 20 мин.

^* (Оставшиеся в воде препараты использовать для проведения проверки по Браше.)

3. Сполоснуть их водой.

4. Обсушить (быстро) препараты фильтровальной бумагой.

5. Быстро сполоснуть препараты из капельниц ацетоном, ацетон-ксилолом (9:1), ацетон-ксилолом (5:5), ацетон-ксилолом (1:9), чистым ксилолом.

6. Заключить препараты в канадский бальзам.

7. Наблюдать дифференцированное окрашивание структур, содержащих ДНК и РНК.

Проверка специфичности реакции на РНК по Браше

1. Поместить оставшиеся в воде препараты в 0,1 - 1%-ный раствор рибонуклеазы в термостат при 37-40° С на 1-3 ч для разрушения РНК.

2. Сполоснуть препараты дистиллированной водой.

3. Провести реакцию с метиловым зеленым - пиронином.

4. Наблюдать появление зеленой окраски ядер.

Результаты реакций (табл. 21, 22, 23)

Таблица 21. Реакция с метиловым зеленым - пиронином на РНК и ДНК. Зерновка кукурузы. А - общий вид зерновки кукурузы в разрезе; Б - детали строения зерновки кукурузы; 1 - зародышевый корешок; 2 - щиток; 3 - всасывающий эпителий; 4 - алейроновый слой и прилегающие клетки эндосперма; 5 - алейроновый слой в нижней части зерновки; 6 - эндосперм около средней части щитка; 7 - эндосперм из центральной части зерновки; 8 - колеоптиле; 9 - точка роста почечки; 10 - проводящие пучки: 11 - колеориза (увеличение 7 X 8 и 7 X 40)

Во всех тканях зародыша зерновки кукурузы происходит интенсивное окрашивание ядер в синий и цитоплазмы и ядрышка в розовый цвета. В щитке окрашивание несколько более бледное. В алейроновом слое интенсивно окрашиваются все элементы. В эндосперме окраска ядер и цитоплазмы очень бледная.

Таблица 22. Реакция с метиловым зеленым - пиронином на РНК и ДНК. Кончик корешка лука. А - общий вид кончика корешка лука в разрезе; Б - детали строения кончика корешка лука; 1 - корневой чехлик; 2 - зона деления; 3 - зона растяжения (увеличение 7 X 8 и 7 X 40)

В копчике корешка лука цитоплазма клеток зоны деления окрашивается в интенсивно-розовый цвет, покоящиеся ядра - в голубой, делящиеся ядра - в синий, ядрышки - в розовый. По мере удаления от точки роста все элементы окрашиваются более бледно.

Таблица 23. Реакция с метиловым зеленым - пиронином после действия рибонуклеазой. Кончик корешка лука. А - общий вид кончика корешка лука в разрезе; Б - детали строения кончика корешка лука; 1 - корневой чехлик; 2 - зона деления; 3 - зона растяжения (увеличение 7 X 8 и 7 X 40)

На препаратах, подвергнутых действию рибонуклеазы, цитоплазма и ядрышки бесцветные, ядра зеленые.

В случае если хочется, чтоб выходные прошли шикарно, советуем ознакомиться с секс услугами наших проституток. Будьте убеждены, что проститутки Москвы приспособлены вас изумить. | Хотите заниматься сексом в обществе самостоятельной индивидуалки? Секс сайт http://prostitutkihabarovskasex.com предписывает попользоваться услугами интимных индивидуалок, которые согласны даже на исследованьи в постели.