Реакция на неспецифическую щелочную фосфатазу

Механизм реакции состоит в образовании фосфата кальция из ионов кальция и фосфорной кислоты, освободившейся под воздействием фосфатазы объекта на различные фосфорные эфиры.

Для обнаружения щелочной фосфатазы объект (срез) погружают в среду, содержащую органический фосфорный эфир (например, аденозинтрифосфат - АТФ^*), кальциевую соль (хлорид кальция), а также соль магния, так как ионы магния активируют действие фермента. Среда должна иметь pH≥9. В дальнейшем образовавшийся осадок фосфата кальция превращают в более заметный темно-коричневый осадок сульфида кобальта.

^* (Глицерофосфат натрия, применяемый для тканей животных, непригоден для растительных тканей.)

Последовательность операций, ведущих к обнаружению щелочной фосфатазы, такова: остаток фосфорной кислоты, отщепленный от аденозинтрифосфата (или другого фосфата), вступает в реакцию с ионами кальция и образует бесцветный осадок фосфата кальция. При дальнейшем действии на препарат нитратом кобальта последний замещает кальций, образуя соединение с фосфорной кислотой. При последующем взаимодействии с сульфидом аммония возникает окрашенный осадок сульфида кобальта. В то время как бесцветный осадок фосфата кальция малодоступен для наблюдения, осадок сульфида кобальта хорошо заметен. Количество осадка этого соединения эквивалентно количеству осадка фосфата кальция и указывает на активность действия фермента.

Реактивы

1) Среда, содержащая фосфорный эфир.

Приготовление среды. Слить 10 мл 3%-ного раствора аденозинтрифосфата, 10 мл 2%-нога раствора веронала или мединала, 5 мл дистиллированной воды, 20 мл 2%-ного раствора хлорида кальция и 1 мл 5%-ного раствора сульфида магния.

2) 2%-ный раствор азотнокислого или уксуснокислого кобальта.

3) Разведенный раствор сульфида аммония (желтый сульфид аммония).

4) 96%-ный спирт.

5) 100%-ный спирт.

6) Смесь спирта с ксилолом (1:1).

7) Ксилол.

8) Канадский бальзам.

9) Глицерин.

Проведение реакции

1. Поместить срезы в среду, содержащую фосфат, соль кальция, соль магния и веронал или мединал (для создания соответствующего pH) на срок от 0,5 до 16 ч при 37° С.

2. Промыть срезы водой.

3. Обработать их уксуснокислым или азотнокислым кобальтом в течение 3-5 мин.

4. Промыть срезы водой.

5. Обработать срезы раствором сульфида аммония в течение 1-2 мин.

6. Фиксированные срезы заключить в канадский бальзам, свежие - в глицерин.

7. Наблюдать выпадение темно-коричневого осадка.

Результаты реакции

В кончике корешка лука (фиксированный материал) сульфид кобальта выпадает в виде округлых коричневых гранул, которые пронизывают цитоплазму. Наибольшее количество щелочной фосфатазы обнаруживается в клетках зоны деления; ее мало в зоне растяжения и почти нет в клетках чехлика.

Такое распределение фермента является вполне закономерным. Сферу его наибольшей активности представляют клетки с интенсивной жизнедеятельностью, в которых, очевидно, интенсивно протекают и гидролитические и синтетические процессы.