Реакция на аэробные дегидрогеназы с метиленовой синей

Сущность метода состоит в том, что окисленная форма метиленовой синей, имеющая синюю окраску, при соединении с водородом, отнятым от субстрата дегидрогеназой, переходит в восстановленную бесцветную лейкоформу.

Метиленовая синяя состоит из многокольчатого гетероциклического ядра, в которое входят хинонимидные группировки.

Поскольку лейкоформа метиленовой синей легко окисляется кислородом воздуха, причем раствор ее снова окрашивается, следует ограничить доступ кислорода к препарату (например, окантовав края покровного стекла парафином).

Реакция с метиленовой синей для обнаружения в объекте неспецифических дегидрогеназ идет без добавления к исследуемому объекту специального субстрата. В этом случае субстратом, обусловливающим действие неспецифических дегидрогеназ объекта, являются ткани объекта, от которых дегидрогеназы и отнимают водород, передавая его метиленовой синей.

Реактивы

0,05%-ный раствор метиленовой синей.

Проведение реакции

1. Погрузить срез на 15 мин в раствор метиленовой синей, находящейся на предметном стекле.

2. Края покровного стекла окантовать парафином.

3. Наблюдать обесцвечивание объекта, проходящее с различной быстротой в различных тканях.

Специфичность реакции на дегидрогеназы можно проверить, разрушив их действием высокой температуры и повторно проведя реакцию.

Проверка специфичности реакции

1. Срезы подогревать в пробирке с водой до 90° С в течение 5 мин, не доводя до кипения (для удаления дегидрогеназ).

2. Проделать реакцию с метиленовой синей.

Отсутствие обесцвечивания метиленовой синей укажет на отсутствие дегидрогеназ.

Результаты реакции (табл. 24, 25)

Таблица 24. Реакция на аэробные неспецифические дегидрогеназы с метиленовой синей. Зерновка кукурузы. А - зерновка после погружения в реактив; Б - начало обесцвечивания зародыша; В - полное обесцвечивание зародыша (увеличение 7 X 8)

Все клетки листа капусты при погружении в метиленовую синюю густо окрашиваются.

По мере действия дегидрогеназ начинается обесцвечивание прежде всего пучка и окружающих его паренхимы и колленхимы, затем паренхимы листа, начиная от пучков. Это указывает на то, что очагом наиболее интенсивных окислительно-восстановительных процессов являются камбий, флоэма и смежные с ними ткани.

Таблица 25. Реакция на аэробные неспецифические дегидрогеназы с метиленовой синей. Лист капусты. 1 - эпидермис; 2 - паренхима листа; 3 - колленхима пучка; 4 - ксилема; 5 - камбий; 6 - флоэма (увеличение 7 X 8)

В зерновке кукурузы обесцвечивание метиленовой синей начинается прежде всего в почечке и корешке зародыша, а также в проводящих пучках щитка, далее обесцвечивается весь зародыш. Эндосперм остается окрашенным. Подобное ослабление окраски находится в соответствии со степенью жизнедеятельности отдельных частей зародыша и всей зерновки.