Реакция на аэробные дегидрогеназы с солями тетразолия

Принцип реакции состоит в восстановлении бесцветных солей тетразолия под действием дегидрогеназ в окрашенные соединения - формазаны.

Соли тетразолия очень разнообразны. В настоящее время для гистохимических целей признаны наилучшими неотетразолий, синий дитетразолий и нитросиний тетразолий.

Восстановление синего дитетразолия под действием дегидрогеназ происходит следующим образом:

При неполном восстановлении образовавшийся продукт может быть красным или фиолетовым.

Реакция на неспецифические дегидрогеназы идет без добавления к объекту специального субстрата.

Реактивы

1) Фосфатный буфер (pH=7,7).

Приготовление фосфатного буфера. Приготовить исходные 1/15 М растворы

Na₂HPO₄•2H₂O и KH₂PO₄, растворив 11,876 г Na₂HPO₄•2H₂O в 1 л дистиллированной воды и 9,078 г KH₂PO₄ тоже в 1 л дистиллированной воды. Полученные растворы слить в отношении 9:1.

2) 0,1%-ный раствор синего дитетразолия на фосфатном буфере.

3) 10%-ный формалин.

4) 15%-ный спирт.

5) Глицерин.

Проведение реакции

1. Поместить срезы в 0,1%-ный раствор синего дитетразолия, приготовленного на фосфатном буфере, на 5-30 мин при 37° С.

2. Наблюдать появление синего осадка формазана.

3. Зафиксировать срезы в 10%-ном формалине (10 мин).

4. Промыть их в 15%-ном спирте (5 мин).

5. Заключить срезы в глицерин.

Результаты реакции (табл. 26)

Таблица 26. Реакция на неспецифические дегидрогеназы с синим дитетразолием. Зерновка кукурузы. А - общий вид зерновки кукурузы в разрезе; Б - детали строения зерновки кукурузы; 1 - зародышевый корешок; 2 - щиток; 3 - всасывающий эпителий; 4 - алейроновый слой и прилегающие клетки эндосперма; 5 - эндосперм из центральной части зерновки; 6 - колеоптиле; 7 - точка роста почечки; 8 - проводящие пучки; 9 - колеориза

Эндосперм зерновки кукурузы, в том числе и алейроновый слой, не дает реакции с тетразолием. Интенсивную реакцию дает весь зародыш. При этом наиболее сильно она проявляется в корешке и почечке. Реакция выражается в появлении синих гранул в цитоплазме клеток. Гранулы располагаются поодиночке и группами, более или менее густо. Больше всего их в клетках будущей проводящей системы корешка.