Реакция на пероксидазу с бензидином

В присутствии перекиси водорода и пероксидазы бензидин образует более сложное соединение из двух молекул, окрашенное в синий цвет. Оно постепенно разлагается с образованием бурого вещества.

Недостатком бензидиновой реакции является ее диффузность. Для ее устранения к реактиву добавляют молибденовокислый аммоний, который осаждает окрашенное вещество.

Реактивы

1) 0,85%-ный раствор поваренной соли.

2) 0,1%-ный раствор молибденовокислого аммония на солевом растворе.

3) Насыщенный раствор бензидина в солевом растворе.

4) 20%-ный раствор перекиси водорода.

5) Смесь перекиси водорода с бензидином из расчета 1 капля перекиси водорода на 2 мл бензидина (смешать перед употреблением).

Проведение реакции

1. Поместить срезы в 0,85%-ный раствор поваренной соли при 4° С в часовом стекле на 3 мин.

2. Обработать срезы раствором 0,1%-ного молибденовокислого аммония в солевом растворе в течение 5 мин.

3. Обработать срезы раствором бензидина, смешанного перед употреблением с перекисью водорода, в течение 5 мин (до появления синей окраски).

4. Промыть срезы свежим охлажденным солевым раствором.

5. Наблюдать локализацию синей окраски.

Результаты реакции (табл. 28, 29)

Таблица 28. Бензидиновая реакция на пероксидазу. Лист капусты, эпидермис; 2 - паренхима листа; 3 - колленхима пучка; 4 - ксилема; 5 - камбий; 6 - флоэма (увеличение 7 X 8)

В листе капусты в местах скопления активной пероксидазы выпадают синие кристаллы. Реакция идет во всех тканях листа с заметной интенсивностью, причем более или менее равномерно во всей паренхиме. В пучках особенно интенсивно красится флоэмная часть. Камбий окрашивается значительно слабее. Обилие пероксидазы во флоэме, по-видимому, объясняется тем, что пластические вещества, передвигающиеся по клеткам, подвергаются частичному окислению и расходуются на синтез веществ новых клеток, образуемых камбием.

Таблица 29. Бензидиновая реакция на пероксидазу. Зерновая кукурузы. А - общий вид зерновки кукурузы в разрезе; Б - детали строения зерновки кукурузы; 1 - зародышевый корешок; 2 - щиток; 3 - всасывающий эпителий; 4 - алейроновый слой и прилегающие клетки эндосперма; 5 - алейроновый слой в нижней части зерновки; 6 - эндосперм около средней части щитка; 7 - эндосперм из центральной части зерновки; 8 - колеоптиле; 9 - точка роста почечки; 10 - проводящие пучки; 11 - колеориза (увеличение 7 X 8 и 7 X 40)

В зерновке кукурузы реакция протекает с незначительной интенсивностью. В зародыше окраска почти такая же слабая, как и в эндосперме. Более интенсивная окраска характеризует проводящие элементы. Окраска цитоплазмы клеток, дающих реакцию, неравномерна, пластиды окрашиваются значительно сильнее, чем цитоплазма.