Реакция на пероксидазу с гваяколом

Гваякол - монометиловый эфир пирокатехина - при взаимодействии с пероксидазой дает ярко-коричневую окраску, обусловленную образованием тетрагваякохинона.

Если пероксидаза активна и ее много, то образуется очень много продукта реакции. Замедлить (для удобства наблюдения) протекание реакции можно, понижая pH среды, т. е. подкисляя реактив. Этот же фактор уменьшает и диффузию продукта реакции.

Реактивы

1) 0,03%-ный раствор перекиси водорода.

2) 0,7%-ный раствор гваякола.

3) 25%-ная уксусная кислота.

Проведение реакции

1. Для устранения диффузии продукта реакции подействовать на объекты (срезы) 25%-ной уксусной кислотой.

2. Капнуть на срезы 0,03%-ным раствором перекиси водорода.

3. Добавить каплю раствора гваякола и накрыть покровным стеклом.

4. Наблюдать появление оранжево-коричневого окрашивания.

Результаты реакции (табл. 30, 31)

Таблица 30. Реакция с гваяколом на пероксидазу. Лист капусты. 1 - эпидермис; 2 - паренхима листа; 3 - колленхима пучка; 4 - ксилема; 5 - камбий; 6 - флоэма (увеличение 7 X 8)

Реакция протекает во всех тканях листа капусты. В паренхиме листа, за исключением субэпидермальных слоев, она незначительна. В клетках, окружающих пучок, и во флоэме окраска особенно яркая, что указывает на интенсивно протекающие в этих тканях процессы окисления.

В зерновке кукурузы эндосперм почти не окрашивается, интенсивную реакцию дает только алейроновый слой. В зародыше окраска более яркая, чем в эндосперме. Наиболее сильно окрашивается эпителий щитка, корешок, почечка и прилегающие к ним зоны, а также проводящая система щитка. Таким образом, яркая окраска характерна для всех участков интенсивного синтеза.

Таблица 31. Реакция с гваяколом на пероксидазу. Зерновка кукурузы. А - общий вид зерновки кукурузы в разрезе; Б - детали строения зерновки кукурузы; 1 - зародышевый корешок; 2 - щиток; 3 - всасывающий эпителий; 4 - алейроновый слой и прилегающие клетки эндосперма; 5 - алейроновый слой в нижней части зерновки; 6 - эндосперм около средней части щитка; 7 - эндосперм из центральной части зерновки; 8 - колеоптиле; 9 - точка роста почечки; 10 - проводящие пучки; 11 - колеориза (увеличение 7 X 8 и 7 X 40)

Характерным для гваяколовой реакции является окрашивание оболочек в некоторых тканях. Причины такого окрашивания не выяснены.

Как правило, ферменты обнаруживаются в тканях с наиболее высоким уровнем жизненных процессов. Так, в зародыше кукурузы встречается весь набор определяемых ферментов, причем центром их наиболее активной деятельности является корешок и почечка. Обычно первые продукты ферментативной деятельности обнаруживаются именно в этих органах (например, обесцвечивание метиленовой синей распространяется по зародышу, начиная с почечки и корешка).

При сопоставлении реакций на различные дыхательные ферменты в зародыше зерновки кукурузы оказывается, что наиболее интенсивна реакция на цитохромоксидазу, слабее на пероксидазу.

Ткани эндосперма, превратившиеся в пассивный склад запасных веществ, не дают реакции на дегидрогеназы и цитохромоксидазу. Обнаруживается лишь пероксидаза. Алейроновый слой остается жизнеспособным и дает реакции на цитохромоксидазу и пероксидазу, однако не проявляет дегидрогеназной активности.

Подобным образом центром деятельности ферментов в листе капусты являются живые клетки проводящего пучка, обеспечивающие передвижение пластических веществ в растении. Паренхимные клетки мякоти листа, являясь вполне жизнеспособными, также содержат ферменты (дегидрогеназы, цитохромоксидазу" пероксидазу). Естественно, что между тканями пучка и паренхимой листа нет такой большой разницы в оснащенности ферментами, какая наблюдается между тканями зародыша и эндосперма.