НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

Макромолекулярные адгезивные факторы и их биологическая активность (Маленков А. Г., Ямская В. П.)

Из многих биологических объектов (губок, эмбриональных тканей птиц и млекопитающих, культуры тканей насекомых) получены макромолекулярные факторы, способные видо- или тканеспецифично влиять на адгезивные свойства клеток. Эти факторы действуют именно на те ткани, из которых они выделены. Разнообразие объектов предопределяет и различия содержания понятия "влияние на адгезивные свойства". Так, АФ, полученные из губок или эмбриональных тканей, оценивают по способности их индуцировать или ускорять агрегацию соответствующих клеток после дезинтеграции исходной ткани; АФ, выделенные из тканей взрослых животных (контактины),- по способности восстанавливать механические и другие (в том числе ультраструктурные) характеристики МК. В последнем случае для оценки действия АФ используют не суспензию клеток, а ткань с частично разрушенными предварительным воздействием (например, при инкубации в бескальциевом растворе) МК или ткань животных, обладающих определенными генетически детерминированными дефектами МК. Контактины проявляют адгезивную активность in vitro и in vivo. Они обладают также агрегационной активностью, хотя она не столь выражена, как у факторов, полученных из эмбриональных тканей. Это обусловлено прежде всего тем, что клетки дефинитивных тканей в меньшей мере способны к агрегации. Способность АФ действовать на частично разрушенные или генетически дефектные МК не исследована и эти факторы не изучены. В связи с этим не установлено, образуют они единый класс (по молекулярной природе, биологической функции, механизму действия) или нет.

АФ и контактины обладают и общими признаками: их действие тканеспецифично, для проявления его необходимы ионы Ca2+, получают эти вещества из смывов ткани бескальциевыми растворами, все АФ представляют собой макромолекулы - белки - и для них (изученных) характерна колоколообразная зависимость эффекта от дозы.

Трудность сопоставления различных АФ обусловлена отсутствием единых общепринятых представлений о механизме адгезии и различиями механизмов контактных взаимодействий у разных объектов.

Структуры (плотные соединения, зоны слипания и др.) различаются по расстоянию между соседними мембранами, топологии ультраструктуры контакта, характеру разрыва (адгезивный или когезивный), устойчивости к разрушающим факторам (комплексоны, гидростатическое давление, рН и т. д.). Поэтому представляется очевидным, что молекулярные механизмы адгезии существенно различны в пределах разных ультраструктур. При образовании же контакта de novo ультраструктуры возникают не одновременно. В "онтогенезе" МК и отдельных его ультраструктур роль различных механизмов адгезии на каждом этапе, вероятно, неодинакова. В МК дефинитивных эпителиев физические силы Ван-дер-Ваальса играют второстепенную роль, обеспечивая не более 20% общей энергии взаимодействия (А. Г. Маленков, 1976). На первых этапах адгезии роль этих сил может быть намного выше.

Все существующие гипотезы предполагают определящую роль ткане- или видоспецифических взаимодействий макромолекулярных компонентов поверхности. Однако, как происходит это взаимодействие, еще не выяснено. Возможно, оно осуществляется по типу фермент-субстратного комплекса, полимерного клея или систем антиген-антитело, фактор-рецептор.

Представляется целесообразным использовать эндогенные АФ управления физиологическим состоянием и траекториями морфогенетических процессов in vivo. Эти факторы специфичны, не токсичны, действуют в низких дозах.

Здесь мы приводим данные об АФ, полученных только из организмов высших животных. Сведения о химических свойствах всех АФ читатель может найти в работе В. П. Ямсковой, М. М. Резниковой (1979).

При обработке трипсином эмбриональных тканей теплокровных животных можно получить суспензию отдельных клеток, способных через некоторое время образовывать агрегаты. Реагрегация эмбриональных клеток - процесс тканеспецифический (A. A. Moscona, 1957). Так, эмбриональные клетки печени, почечных канальцев, зачатков конечностей образуют агрегаты только с гомологичными клетками.

В процессах агрегации участвуют вещества белковой природы - факторы агрегации клеток (ФАК). Они обнаружены при реагрегации различных тканей животных, но наиболее изученным объектом является сетчатка глаза эмбриона цыпленка (СГЭЦ). E. H. Creaser, R. M. Russel (1971), H. Daday, E. H. Creaser (1970) экстрагировали трипсиндиссоциированные клетки СГЭЦ раствором ЭДТА и выделили, а затем очистили ФАК. Была установлена зависимость между концентрацией ФАК и средним диаметром образующихся агрегатов, по которой определяли степень агрегации. Зависимость имела экстремальный характер: максимальную агрегацию наблюдали при уровне АФ 30-100 мкг/мл. При содержании ФАК 150 мкг/мл и больше отмечалось ингибирование агрегации. Инкубация с трипсином приводила к инактивации фактора. По данным, полученным при гель-фильтрации на сефадексе С-200, ФАК - пептид с молекулярной массой около 6000. Он способен образовывать большие агрегаты с количеством клеток до 8 ⋅ 105. В дальнейших исследованиях с применением новых методов очистки эти же авторы выделили ФАК с молекулярной массой около 1000.

R. E. Hausman, A. A. Moscona (1975) монослойную культуру СГЭЦ обрабатывали раствором, не содержащим Ca2+. Сложная процедура очистки, включающая хроматографию на сефадексе С-200, на ДЭАЭ-целлюлозе, изоэлектрофокусирование в градиенте сахарозы, позволила получить гомогенный ФАК - гликопротеин с молекулярной массой 50 000. Гомогенность его была доказана методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Обработка трипсином приводила к инактивации фактора; нейраминидаза, гиалуронидаза, перйодат калия не влияли на его активность. В этом исследовании была также выявлена зависимость степени агрегации от количества ФАК. Активность фактора на каждом этапе очистки оценивалась интервалом концентраций, при которых наблюдалась максимальная активность. После конечной стадии (изоэлектрофокусирования) такой интервал составлял 0,2- 1 мкг белка/мл. Исследование аминокислотного состава показало, что ФАК содержит значительное количество дикарбоновых аминокислот (аспарагиновой и глютаминовой) и не имеет в своем составе серусодержащих. Такому составу соответствует значение изоэлектрической точки 3,8-4,1. За агрегационную активность ответствен белковый компонент ФАК.

R. Zink и соавторы (1970) обнаружили ФАК при агрегации эмбрионов дрозофилы. S. В. Oppencheiiner, T. Humphreys (1971) выделили ФАК из мышиной тератомы 129. По данным этих авторов, для реагрегации трипсиндиссоциированных клеток мышиной тератомы 129 требуется присутствие в культуральной среде 1-глутамина, необходимого для биосинтеза гликопротеинов. Выделенный ФАК представлял собой углеводсодержащий биополимер с молекулярной массой около 1 ⋅ 106. Обработка трипсином или ЭДТА уменьшала активность фактора. Нагревание ФАК до 100° С вызывало его инактивацию. ФАК способствовал тканеспецифической агрегации живых и фиксированных формалином клеток тератомы. Процесс агрегации наблюдали только при 37° С; при 4° С клетки не агрегировали.

J. Bolsamo, J. Libien (1975) исследовали факторы, присутствующие в супернатантах, полученных из культур тканей сетчатки и мозга. Эти вещества специфически связывались с клеттоцитов. Десмосома (Д) ПРИ действии разрывающего усилия на контакт гепанами того вида, из которого они были выделены, и ускоряли агрегацию этих клеток. Авторы установили, что специфичность связывания фактора с клетками зависит от остатка сахара в углеводной части гликопротеинового комплекса. Было высказано предположение, что взаимодействие ФАК сетчатки с гомологичными клетками осуществляется через концевой остаток N-ацетилгалактозамина, а ФАК мозга - через остаток маннозамина.

Исследование агрегации эмбриональных клеток печени провел G. Kuroda (1968). Он отметил, что в смешанной суспензии клеток эмбрионов различных возрастов (7- и 18-дневных, 10- и 14-дневных) образовавшиеся агрегаты содержали только клетки эмбрионов одного возраста. Экстракты, полученные при помещении ткани в бескальциевую среду, проявляли агрегационную активность, которая обладала свойством "возрастной" специфичности. Так, при температуре 38° С экстракт, полученный из печени 7-дневного эмбриона, был активен по отношению к клеткам 7-дневного эмбриона, а после длительного инкубирования - к клеткам 18-дневного эмбриона. Экстракт из печени 18-дневного эмбриона не проявлял активности по отношению к клеткам 18- и 7-дневного эмбрионов. Таким образом, на поздних этапах эмбриогенеза либо появляются ФАК, отличные от таковых на ранних этапах, либо механизм адгезии становится иным.

При исследовании инактиватора агрегации клеток, присутствующего на плазмолеммах оптического нерва и СГЭЦ, D. J. Jottlieb и соавторы (1975) обнаружили, что фракции плазмолемм тканеспецифически угнетали клеточную адгезию. С помощью экстракции дийодсалицилатом лития был выделен инактиватор, представляющий собой углеводсодержащий белок с молекулярной массой 60 000. По мнению авторов, количество инактиватора не превышает 1 % общего содержания белков плазмолеммы. Была отмечена "возрастная" специфичность инактиваторов агрегации клеток 7- и 9-дневных эмбрионов. Это позволило авторам сделать предположение: механизм клеточного "узнавания" изменяется в процессе эмбриогенеза.

ФАК были выделены также при обработке бескальциевой средой клеток различных линий мышиной лимфобластомы (РЗЗЗ), фибробластов крысы (PEP), хомяка (MEF (Nil-2), мыши (MEF, ЭТЗ, ЗT3-SV (40), эпителиальных клеток человека (Hela, Wl-38-2PA) и мыши (NCTC 2555 (2). Инкубация с проназой, трипсином, коллагеназой, нейраминидазой, РНК- и ДНК-азами не влияла на активность ФАК, полученных из культур этих линий, тогда как обработка гиалуронизадой и перйодатом их инактивировала. Следовательно, в данном случае ФАК представляют собой кислые полисахариды, подобные гиалуроновой кислоте и хондроинтинсульфатам, которые входят в состав межклеточного вещества соединительной ткани. Это подтвердилось тем, что гиалуроновая кислота проявляла ФАК-активность по отношению к исследуемым типам клеточных линий. B. Pessak, V. Defendi (1972) установили, что сыворотки крови различных животных содержат ФАК. Активным началом, по-видимому, в этом случае также являются кислые мукополисахариды. ФАК сыворотки крови не обнаруживают специфичности по отношению к источнику получения сыворотки (цыпленок, теленок, лошадь) и действия на агрегацию клеток различных линий.

Проявление сыворотками крови агрегационной активности отмечали также и другие исследователи. J. Libien, A. A. Moscona (1967) сообщили, что неспецифическую ФАК-активность сыворотка утрачивает при диализе. Orr, Resmanu (1972) выделили из сыворотки лошади и очистили белок, который вызывал агрегацию клеток СГЭЦ. Он был термолабилен и имел молекулярную массу не менее 1 ⋅ 106. ФАК сыворотки взаимодействовал с антителами, полученными против иммуноглобулина М. И, хотя молекулярная масса ФАК была больше, чем иммуноглобулина М, авторы предположили, что исследуемый фактор агрегации является или иммуноглобулином сыворотки, или подобным ему белком.

Так как данные о неспецифических ФАК малочисленны и противоречивы, этот вопрос нуждается в дальнейшем исследовании. Результаты, полученные В. Pessak, V. Defendi (1972), отличаются от ранее изложенных. Это можно объяснить тем, что последнее исследование было проведено на клетках соединительной ткани и трансформированных. Кроме того, в процессе поддержания линий, пассажей и культивирования клетки могли утратить ряд специфических характеристик клеточной поверхности и контактов, свойственных клеткам, полученным непосредственно из ткани. Известно, что трансформированные вирусами или спонтанно трансформированные клетки содержат на своей поверхности больше мукополисахаридов, чем соответствующие нетрансформированные клетки.

ФАК, обладающий гормональнозависимым действием, наблюдали при изучении реагрегации клеток щитовидной железы - КЩЖ (A. Giroud и др., 1974). КЩЖ, полученные при обработке щитовидной железы трипсином, образовывали монослой, типичный для эпителиальных клеток. В присутствии гормона адено- гипофиза - тиротропина - КЩЖ были способны реагрегировать с образованием гистотипических фолликулярных структур, которые морфологически характерны для щитовидной железы. Такие клеточные ассоциаты проявляли свойства щитовидной железы: синтезировали специфические гормоны и накапливали йод. Для образования фолликулярных структур из монослоя КЩЖ в присутствии тиротропина необходимо наличие в среде специфического ФАК. Выделение фактора производили обработкой культуры КЩЖ бескальциевой средой. ФАК щитовидной железы представляет собой макромолекулярное термостабильное вещество. Его можно инактивировать инкубацией с проназой. Частичную инактивацию наблюдали после обработки ФАК гиалуронидазой или трипсином.

Новый подход в исследовании адгезии клеток тканей млекопитающих осуществлен А. Г. Маленковым, Е. А. Модяновой (1970). В процессе перфузии печени мышей бескальциевым раствором авторы наблюдали резкое возрастание количества выделяющихся клеток. Если в перфузирующий раствор добавляли ионы Ca2+ и продолжали перфузию таким раствором еще некоторое время, то восстановления межклеточного взаимодействия не отмечалось. Состояние МК в ткани печени оценивали по силе сцепления клеток, которую определяли методом D. R. Coman (1944). В процессе исследования был разработан другой метод - состояние МК оценивалось по количеству клеток, выделившихся при мягком диспергировании ткани. Добавление ионов Ca2+ к перфузированной ткани печени способствовало лишь частичному восстановлению сцепления между клетками. Было установлено, что при перфузии печени мыши бескальциевым раствором механические свойства ткани изменяются поэтапно. Первая фаза - латентная. При продолжительности перфузии 30- 40 мин, скорости перфузии 2-3 мл/мин не происходит существенного изменения в механическом сцеплении клеток. При перфузии в течение 40-90 мин наступает резкое уменьшение сцепления клеток. Добавление ионов Ca2+ способствует восстановлению МК (обратимая фаза). Перфузия бескальциевым раствором свыше 90-100 мин приводит к тому, что добавление ионов Ca2+ не восстанавливает сцепление между клетками (необратимая фаза). После 120-минутной перфузии наступает вторая фаза изоляции клетки, которая сопровождается перестройкой плазмолеммы и МК. По мнению авторов, именно во второй фазе (необратимой) происходит вымывание АФ - контактина и поэтому добавление ионов Ca2+ не восстанавливает контактного взаимодействия между клетками. Перфузат вместе с ионами Ca2+ восстанавливал механические свойства контакта между паренхиматозными клетками печени. Было сделано предположение, что активным началом в перфузате является АФ - контактин. Контактин из ткани легкого был получен при экстракции ткани в бескальциевом растворе. Действие его и контактина из ткани печени на адгезию клеток было тканеспецифично, однако видовая специфичность не наблюдалась (Е. А. Модянова, 1974; В. П. Ямскова и др., 1977). Был предложен метод очистки контактина, основанный на экстракции его бескальциевым раствором из ткани печени и легкого. Полученные высокоочищенные препараты контактина были стабильны в растворе Рингера, содержащем ионы Ca2+, в течение года при низких температурах. Из сыворотки крови крыс было выделено вещество, проявляющее неспецифическую активность( НАФ). Кипячение в течение 5 мин не уменьшало активности этого препарата, а препараты из печени и легкого полностью инактивировались в этих условиях. Гомогенность препаратов была доказана методом электрофореза. Биологическую активность препаратов контактина печени и легкого изучали несколькими методами. Определяли количество гепатоцитов, выделившихся при диспергировании из ткани, у которой предварительно были ослаблены МК, производили оценку механического сцепления клеток в ткани, измеряемого с помощью микроманипулятора, агглютинацию гепатоцитов, измерение устойчивости суспензии клеток к механическому воздействию. По мнению авторов, два первых метода применимы для оценки стабильности МК, а методы второй, последний и выделения клеточных ядер при гомогенизации ткани позволяют определить влияние контактина на стабильность плазмолеммы. Третий метод характеризует взаимодействие контактина с компонентами клеточной поверхности.

Выявлена зависимость всех исследованных биологических эффектов от концентрации контактина в растворе. Последнее указывает, что одна молекула контактина взаимодействует с несколькими рецепторами, локализованными на плазмолемме. НАФ также способствовал увеличению адгезии клеток в ткани. Обнаружена зависимость биологического эффекта от количества НАФ в растворе, которая также характеризовалась определенным интервалом активных концентраций.

Для сравнения полученных высокоочищенных препаратов АФ печени и легкого и НАФ из сыворотки крови исследован их химический состав. АФ печени и легкого имеют аминокислотные составы, характерные для углеводсодержащих белков. Оба вещества содержат большие количества оксиаминокислот, особенно серина, а также дикарбоновых аминокислот, но не содержат цистеина и метионина. В состав АФ входили углеводы, причем масса их была в 3 раза больше, чем аминокислот. НАФ из сыворотки крови не содержит аминокислот и состоит только из углеводов.

Изложенные данные позволяют предположить следующий механизм действия АФ и его локализации на плазмолемме. Быстрая экстракция АФ свидетельствует о слабой связи его с компонентами клеточной поверхности. Однако эта связь в высокой степени специфична, поэтому взаимодействие АФ с рецептором должно характеризоваться высоким сродством. Возникшее противоречие можно разрешить, предположив, что это взаимодействие осуществляется по многим центрам, каждый из которых отличается малой энергией взаимодействия, и связь между ними осуществляется через конформационно лабильные компоненты молекул. При экстракции ткани бескальциевой средой связь между молекулами контактина, находящимися на поверхности двух соседних клеток, нарушается. При температуре выше + 10° С отсутствие ионов Ca2+ в среде, вероятно, способствует увеличению подвижности компонентов клеточной поверхности. Важную роль латеральной подвижности рецепторов в процессе взаимодействия контактина с поверхностью клетки доказывают следующие факты: при температуре ниже + 10° С в бескальциевом растворе контактин не высвобождается из ткани; в присутствии контактина фиксированные формалином гепатоциты не способны агглютинировать в многоклеточные комплексы, такие, какие образуют нефиксированные клетки. При исследовании биологической активности контактина установлено, что фактор увеличивает устойчивость клеток к механическому воздействию и снижает выход клеток и клеточных ядер при диспергировании ткани. Можно предположить, что контактин, взаимодействуя с определенными компонентами поверхности, способствует организации всей клеточной поверхности, т. е. осуществляет ее топографическую дифференциацию. Возможно, что, по аналогии с ФАК морских губок, высокая специфичность действия контактина определяется небольшими пептидами, избирательно "узнающими" свою поверхность. Препарат НАФ, не содержащий аминокислот и представляющий собой, вероятно, полисахарид, имеет другой механизм взаимодействия с компонентами клеточной поверхности.

Полученные данные коррелируют с результатами исследований, в которых выявлена ведущая роль мукополисахаридов в процессах клеточного "узнавания" и адгезии. Связь мукополисахаридов клеточной поверхности с процессами адгезии характерна не только для высокодифференцированных тканей млекопитающих, но и для тканей беспозвоночных. Обнаружено, что мукополисахариды связаны с белками. Таким образом, углеводсодержащие белки, ответственные за клеточную адгезию и процессы "узнавания", скорее всего являются протеогликанами, а не гликопротеинами.

О биологической роли тканеспецифических факторов, а также об их биологической активности in vitro и in vivo известно очень мало. Существенными представляются следующие факты.

A. Giroud и соавторы (1974) установили, что у взрослых животных синтез АФ, индуцирующего тканеспецифическую агрегацию клеток щитовидной железы, резко усиливается после введения животным тиротропина. Следовательно, уровень синтеза АФ может регулироваться гормонами и часть гормональных эффектов может быть опосредована через этот механизм, т. е. через индукцию специфического АФ, изменяющего состояние МК тироцитов.

Более обстоятельно изучен механизм реализации гормонального эффекта экдизона через индукцию специфического АФ на примере личинок дрозофилы при метаморфозе. Отмечено, что экдизон избирательно повышает синтез АФ при действии на эмбриональные клетки в первичных культурах. Этот эффект специфичен, так как другие вещества, подавляющие пролиферацию этих клеток в той же мере, что и экдизон, не индуцируют синтез АФ. Гормон индуцирует АФ и in vivo при эвагинации имагинальных дисков личинок третьего возраста. Появление указанного АФ на поверхности клеток изменяет их адгезивные свойства. Поскольку известно, что экдистерон избирательно изменяет синтетическую активность очень немногих генов, то процесс можно представить следующим образом: гормон - активность гена (или связной группы близко расположенных генов) - усиление синтеза АФ - изменение адгезивных свойств поверхности - морфогенетический, формообразовательный процесс.

Биологическая активность тканеспецифических экзогенных АФ исследовалась только в отношении контактинов. Последние при введении in vivo (внутрибрюшинно) в малых дозах (10-8 - 10-7 мг белка на мышь) вызывали тканеспецифические изменения механических свойств ткани. Они уменьшали диспергируемость ткани, повышали устойчивость мембран к механическому повреждению. В такой же дозе контактин печени вызывал через 6 ч после введения внутрибрюшинно у мышей линии СВА, имеющих наследственно детерминированные дефекты МК гепатоцитов (меньшее число ВАУ в зоне простого соединения), усиление сцепления и увеличение числа ВАУ до уровня, присущего мышам линий с высокой адгезией гепатоцитов (линия С57В1).

Введение контактина легких (внутрибрюшинно в дозе 10-8 мг белка на мышь) одновременно с уретаном снижало выход аденом легких (через 4 мес) в 2,5 раза по сравнению с введением уретана. Эти дозы контактина почти полностью устраняли первичное действие уретана на механические свойства ткани легких (что и служило критерием подбора условий введения контактина). Более высокие дозы контактина, которые не изменяли адгезивных свойств in vitro и не предотвращали нарушения механических свойств ткани, вызванных уретаном in vivo, не снижали выход индуцированных этим веществом аденом.

In vitro установлена биологическая активность контактинов, что может иметь значение для разработки аспектов их использования. На органных культурах легких и печени показано, что контактины тканеспецифически ингибируют синтез ДНК. Эти эффекты обратимы и по времени следуют за эффектами этих веществ на адгезивные и механические свойства МК и поверхности клеток (А. Г. Маленков, Е. А. Модянова, В. П. Ямскова, 1977, 1978).

предыдущая главасодержаниеследующая глава



Новое древо жизни включит «симбиомов» как отдельные организмы

Предок энтерококков появился 450 миллионов лет назад

Эксперимент на улитках подтвердил классическую идею о «двойной цене самцов»

Генетики строят родословное древо архей

Одноклеточные существа изобрели гарпунные пулеметы

Раскрыт один из секретов тихоходок

Обнаружены гигантские вирусы с расширенным репертуаром генов для синтеза белка

Первые шаги земной жизни




© Злыгостев Алексей Сергеевич, 2001-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://biologylib.ru/ 'BiologyLib.ru: Библиотека по биологии'

Рейтинг@Mail.ru